重组减毒炭疽芽胞杆菌及其应用制造技术

本发明专利技术公开了重组减毒炭疽芽胞杆菌及其应用。本发明专利技术提供了重组菌，为降低和/或抑制炭疽芽胞杆菌AP429 CGMCCNO.4912中mntA蛋白和nos蛋白活性得到的菌。本发明专利技术的实验证明，本发明专利技术炭疽芽胞杆菌(Bacillus anthracis)AP431 CGMCC NO.12321毒力较现有疫苗株A16R大降低，无抗生素抗性标记，能够在菌体的S层表面稳定表达保护性抗原，且该菌株能够形成芽胞。本发明专利技术构建的菌株为新型疫苗的研究打下基础。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，尤其涉及重组减毒炭疽芽胞杆菌及其应用。
技术介绍
炭疽芽胞杆菌(Bacillus anthracis)是一种G+菌，它引起的炭疽是一种烈性传染病，在我国列为乙类传染病，已经列入国家的计划免疫。现批准使用的炭疽疫苗A16R株仍保留有编码毒素的大质粒pXO1，具有一定的残留毒性。因此研究更加安全有效的新型炭疽杆菌疫苗就显得非常有必要。减毒炭疽杆菌作为宿主进行保护性抗原表达是研究新型炭疽杆菌疫苗的一种重要策略，相关研究也已有报道，但由于其培养过程中要求使用抗生素而限制了其使用。因此，利用减毒炭疽杆菌为宿主，通过基础重组技术，采用靶基因整合到染色体实现目标基因稳定表达构建新型的疫苗候选株。其次，采用表面呈现的方法进行抗原表达一直被认为是一种比较理想的外源抗原表达，利于其免疫后机体相关免疫进行抗原提呈。另外考虑到重组菌作为疫苗安全性问题，对菌株的毒力相关基因进行缺失突变也是构建活载体疫苗一种常用的方法。总之，通过一系列基因操作，构建和研究一种新型的炭疽芽胞杆菌疫苗。
技术实现思路
本专利技术一个目的是提供了一种重组减毒炭疽芽胞杆菌。本专利技术提供的重组菌，为降低和/或抑制炭疽芽胞杆菌AP429 CGMCC NO.4912中mntA蛋白和nos蛋白活性得到的菌。上述重组菌中，所述降低和/或抑制炭疽芽胞杆菌AP429 CGMCC NO.4912中mntA蛋白和nos蛋白活性为沉默炭疽芽胞杆菌AP429 CGMCC NO.4912中mntA蛋白编码基因和nos蛋白编码基因的表达。上述重组菌中，所述沉默炭疽芽胞杆菌AP429 CGMCC NO.4912中mntA蛋白编码基因和nos蛋白编码基因的表达为敲除炭疽芽胞杆菌AP429 CGMCC NO.4912中mntA蛋白编码基因和nos蛋白编码基因。上述重组菌中，所述敲除炭疽芽胞杆菌AP429 CGMCC NO.4912中mntA蛋白编码基因和nos蛋白编码基因均采用基因组定点编辑或同源重组的方式进行。上述重组菌中，所述同源重组为λ-red同源重组或sacB基因介导筛选的同源重组或自杀质粒介导的同源重组。所述敲除炭疽芽胞杆菌AP429 CGMCC NO.4912中mntA蛋白编码基因和nos蛋白编码基因包括如下步骤：1)将质粒pSS4332导入宿主菌中，得到表达质粒pSS4332的宿主菌；2)将表达mntA蛋白编码基因上游同源臂、mntA蛋白编码基因的下游同源臂、壮观霉素和I-SceI识别位点的重组载体A导入表达质粒pSS4332的宿主菌中，得到中间菌A；质粒pSS4332表达的归巢内切酶I-sceI将转化入细胞内的的带I-sceI酶切位点的重组载体A进行切割，促进重组载体A与基因组的同源重组；3)将中间菌A进行不加卡那霉素传代培养，使质粒pSS4332丢失，得到敲除mntA蛋白编码基因的重组菌A；4)将质粒pSS4332导入重组菌A中，得到表达pSS4332的重组菌A；5)将表达nos蛋白编码基因上游同源臂、nos蛋白编码基因的下游同源臂、壮观霉素和I-SceI识别位点的重组载体B导入表达pSS4332的重组菌A中，得到中间菌B；质粒pSS4332表达的归巢内切酶I-sceI将转化入细胞内的的带I-sceI酶切位点的重组载体B进行切割，促进重组载体B与基因组的同源重组；6)将所述中间菌B进行不加卡那霉素传代培养，使质粒pSS4332丢失，得到敲除mntA和nos蛋白编码基因的重组菌Bacillus anthracis AP429ΔmntAΔnos。上述重组菌中，所述敲除炭疽芽胞杆菌AP429 CGMCCNO.4912中mntA蛋白编码基因采用的同源重组的mntA蛋白编码基因上游同源臂的核苷酸序列为序列1第1-958位；所述敲除炭疽芽胞杆菌AP429 CGMCCNO.4912中mntA蛋白编码基因采用的同源重组的mntA蛋白编码基因的下游同源臂的核苷酸序列为序列1第1895-2875位；所述敲除炭疽芽胞杆菌AP429 CGMCCNO.4912中nos蛋白编码基因采用的同源重组的nos蛋白编码基因上游同源臂的核苷酸序列为序列2第1-805位；所述敲除炭疽芽胞杆菌AP429 CGMCCNO.4912中nos蛋白编码基因采用的同源重组的nos蛋白编码基因下游同源臂的核苷酸序列为序列2第1872-2680位。上述重组菌中，所述重组菌保藏号为CGMCC NO.12321。将炭疽芽胞杆菌(Bacillus anthracis)AP431于2016年3月30日保藏于中国微生物菌种保藏管委理员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：中国北京市朝阳区大屯路)，保藏号为CGMCC NO.12321，分类命名为炭疽芽胞杆菌(Bacillus anthracis)。上述的重组菌在制备如下1)或2)产品中的应用也是本专利技术保护的范围：1)、炭疽杆菌疫苗；2)、预防和/或治疗炭疽杆菌引发的疾病的产品。本专利技术的另一个目的是提供一种如下1)或2)产品。本专利技术提供的产品，其活性成分为其活性成分为A或B；A为上述的重组菌；B为表达mntA蛋白编码基因上游同源臂和mntA蛋白编码基因的下游同源臂的重组载体和表达nos蛋白编码基因上游同源臂和nos蛋白编码基因的下游同源臂的重组载体；1)、炭疽杆菌疫苗；2)、预防和/或治疗炭疽杆菌引发的疾病的产品。本专利技术表达保护性抗原的重组菌株可以用作炭疽杆菌疫苗，所述免疫制剂优选为灭活疫苗、减毒活疫苗和基因工程疫苗。本专利技术的实验证明，本专利技术炭疽芽胞杆菌(Bacillus anthracis)AP431 CGMCC NO.12321毒力较现有疫苗株A16R大降低，无抗生素抗性标记，能够在菌体的S层表面稳定表达保护性抗原，且该菌株能够形成芽胞。本专利技术构建的菌株为新型疫苗的研究打下基础。附图说明图1为mntA基因敲除的过程示意图。图2为mntA基因敲除株PCR鉴定结果。图3为nos基因敲除株PCR鉴定结果。图4为重组炭疽芽胞杆菌(Bacillus anthracis)AP431免疫印迹分析结果。图5为炭疽芽胞杆菌(Bacillus anthracis)AP431流式细胞术分析结果。图6为炭疽芽胞杆菌(Bacillus anthracis)AP431的芽胞形成能力分析结果。图7为重组炭疽芽胞杆菌(Bacillus anthracis)AP431小鼠毒力评价结果。图8为炭疽芽胞杆菌(Bacillus anthracis)AP431小鼠免疫评价实验结果。图9为炭疽芽胞杆菌(Bacillus anthracis)AP431小鼠免疫保护实验结果。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。B.anthracisAP429于2011年5月26日保藏于中国微生物菌种保藏管委理员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：中国北京市朝阳区大屯路)，保藏号为CGMCC NO.4912，分类命名为炭疽芽胞杆菌(Bacillus anthracis)。实施例1、减毒炭疽芽胞杆菌突变株AP431的获得一、mntA基因的敲除1、通用质粒改造设计带有两个LoxP位点及BamHI、SalI本文档来自技高网...

【技术保护点】
重组菌，为降低和/或抑制炭疽芽胞杆菌AP429CGMCC NO.4912中mntA蛋白和nos蛋白活性得到的菌。

【技术特征摘要】
1.重组菌，为降低和/或抑制炭疽芽胞杆菌AP429CGMCC NO.4912中mntA蛋白和nos蛋白活性得到的菌。2.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于：所述降低和/或抑制炭疽芽胞杆菌AP429CGMCCNO.4912中mntA蛋白和nos蛋白活性为沉默炭疽芽胞杆菌AP429CGMCCNO.4912中mntA蛋白编码基因和nos蛋白编码基因的表达。3.根据权利要求2所述的重组菌，其特征在于：所述沉默炭疽芽胞杆菌AP429CGMCCNO.4912中mntA蛋白编码基因和nos蛋白编码基因的表达为敲除炭疽芽胞杆菌AP429CGMCCNO.4912中mntA蛋白编码基因和nos蛋白编码基因。4.根据权利要求3所述的重组菌，其特征在于：所述敲除炭疽芽胞杆菌AP429CGMCCNO.4912中mntA蛋白编码基因和nos蛋白编码基因均采用基因组定点编辑或同源重组的方式进行。5.根据权利要求4所述的重组菌，其特征在于：所述同源重组为λ-red同源重组或sacB基因介导筛选的同源重组或自杀质粒介导的同源重组。6.根据权利要求1-5中任一所述的重组菌，其特征在于：所述敲除炭疽芽胞杆菌AP429CGMCCNO.4912中mntA蛋白编码基因采用的同源重组的mntA蛋白编码基因...

【专利技术属性】
技术研发人员：王艳春，刘纯杰，袁盛凌，陶好霞，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11