本发明专利技术公开了一种(S)‑5‑氯‑2,3‑二氢‑2‑羟基‑1‑氧代‑1H‑茚‑2‑羧酸甲酯的生物制备方法，其以5‑氯‑2,3‑二氢‑1‑氧代‑1H‑茚‑2‑羧酸甲酯为底物，该底物在生物催化剂、辅因子和辅因子再生系统的存在下，发生还原反应生成(S)‑5‑氯‑2,3‑二氢‑2‑羟基‑1‑氧代‑1H‑茚‑2‑羧酸甲酯，所述的生物催化剂为单加氧酶，所述的辅因子再生系统包括葡萄糖和葡萄糖脱氢酶，所述的还原反应在温度为20‑30℃、pH为7.0‑8.0的水相缓冲液中进行。与现有技术相比，本发明专利技术的整个反应过程中未使用危险品和有机羟化试剂，大大提高了生产过程的经济性，且对环境友好，底物转化率高。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物化工
，具体涉及一种(S)-5-氯-2,3-二氢-2-羟基-1-氧代-1H-茚-2-羧酸甲酯的生物制备方法。
技术介绍
据世界粮农组织统计，由于病虫草害的侵扰给农作物造成的损失相当于世界每年作物产量的三分之一。目前我国农药产品以有机磷、氨基甲酸酯等高毒农药为主，开发高效、低毒、对环境安全的绿色杀虫剂迫在眉睫。噁二嗪类杀虫剂是继除虫菊酯、吡虫啉等杀虫剂之后人们发现的具有划时代意义的新型杀虫剂。茚虫威(indoxacarb)是美国杜邦公司开发的新型噁二嗪类(oxadiazine)杀虫剂，商品名Ammate/Avatar，为钠通道抑制广谱杀虫剂，对几乎所有的鳞翅目害虫均具有杀灭能力，具有杀虫活性高、环境相容性好、对哺乳动物毒性低，对鸟类、鱼类以及益虫安全的优点，是替代高毒有机磷杀虫剂的理想品种。茚虫威(indoxacarb)茚虫威的制备方法的关键是获得其手性中间体(S)-5-氯-2,3-二氢-2-羟基-1-氧代-1H-茚-2-羧酸甲酯(1)。从绿色化学角度来看，从其前体5-氯-2,3-二氢-1-氧代-1H-茚-2-羧酸甲酯一步羟化(2)是最有效的方法：目前公开的生产化合物1的路线有美国杜邦公司(DUPONT)公开的专利，如WO 1992011249，US 5462938，US 5510505和WO 199529171等，该路线使用原
料氢气，需加压釜进行反应，存在爆炸等安全隐患；以及在以上专利的基础上做出某些改进的路线，如CN 105152958，CN 104193696和CN 104193620等。上述化学路线，通常在有机溶剂中进行，均需要加入有机羟化试剂(如有机肼和金鸡纳碱)，该类实际来源有限，价格昂贵，因此其经济性和环境友好性有待提高。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种(S)-5-氯-2,3-二氢-2-羟基-1-氧代-1H-茚-2-羧酸甲酯的生物制备方法，其克服了现有技术的不足，经济性好，对环境友好。为达到上述目的，本专利技术采用的技术方案是：一种(S)-5-氯-2,3-二氢-2-羟基-1-氧代-1H-茚-2-羧酸甲酯的生物制备方法，其以5-氯-2,3-二氢-1-氧代-1H-茚-2-羧酸甲酯为底物，该底物在生物催化剂、辅因子和辅因子再生系统的存在下，发生还原反应生成(S)-5-氯-2,3-二氢-2-羟基-1-氧代-1H-茚-2-羧酸甲酯，所述的生物催化剂为单加氧酶，所述的辅因子再生系统包括葡萄糖和葡萄糖脱氢酶，所述的还原反应在温度为20-30℃、pH为7.0-8.0的水相缓冲液中进行，在起始反应体系中，所述底物5-氯-2,3-二氢-1-氧代-1H-茚-2-羧酸甲酯的浓度为15-25mg/mL，所述的单加氧酶与底物5-氯-2,3-二氢-1-氧代-1H-茚-2-羧酸甲酯的质量比为1:1-20。优选地，所述底物5-氯-2,3-二氢-1-氧代-1H-茚-2-羧酸甲酯的浓度为20mg/mL，所述的单加氧酶与底物5-氯-2,3-二氢-1-氧代-1H-茚-2-羧酸甲酯的质量比为1:10。优选地，所述的单加氧酶为购自苏州汉酶生物技术有限公司生产的牌号为EW1531、EW1535、EW1536或EW1538的单加氧酶中的一种或多种的组合。进一步优选地，所述的单加氧酶为购自苏州汉酶生物技术有限公司生产的牌号为EW1535的单加氧酶。优选地，起始反应体系中，所述的葡萄糖：葡萄糖脱氢酶：5-氯-2,3-二氢-1-氧代-1H-茚-2-羧酸甲酯的质量比为1.6-15:1:1-20；更为优选的，所述的葡萄糖：葡萄糖脱氢酶：5-氯-2,3-二氢-1-氧代-1H-茚-2-羧酸甲酯的投料质量比为15:1:10。优选地，所述的辅因子为NADP，其与5-氯-2,3-二氢-1-氧代-1H-茚-2-羧酸甲酯的质量比为1:1-100，更为优选地，NADP与5-氯-2,3-二氢-1-氧代-1H-茚-2-羧酸甲酯的质量比为1:100。优选地，所述反应在助溶剂条件下进行。进一步优选地，所述的助溶剂为环己烷、聚乙二醇400、聚乙二醇200、甘油、甲苯、乙二醇、吐温-60中的一种或多种的组合。优选地，所述的水相缓冲溶液为磷酸盐缓冲溶液。优选地，具体实施过程如下：在反应容器中依次加入所述的水相缓冲溶液、底物5-氯-2,3-二氢-1-氧代-1H-茚-2-羧酸甲酯，搅拌均匀后，再加入所述的单加氧酶、辅因子、葡萄糖、葡萄糖脱氢酶，在20-30℃温度条件下震荡反应，HPLC检测反应进程，当转化率达90-99％时，过滤除酶后，加入等体积乙酸乙酯进行多次萃取，合并有机相，脱去溶剂后得到(S)-5-氯-2,3-二氢-2-羟基-1-氧代-1H-茚-2-羧酸甲酯产品。由于上述技术方案的运用，本专利技术与现有技术相比具有下列优点：本专利技术采用了生物酶将5-氯-2,3-二氢-1-氧代-1H-茚-2-羧酸甲酯还原生成(S)-5-氯-2,3-二氢-2-羟基-1-氧代-1H-茚-2-羧酸甲酯，整个制备过程在水相中进行，与现有技术相比，无需使用氢气，不会存在爆炸的隐患；同时无需加入有机羟化试剂，经济性好，同时对环境友好，且底物的转化率高、产物ee值高。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术做进一步详细的说明，但本专利技术并不限于以下实施例。实施例中采用的实施条件可以根据具体使用的不同要求做进一步调整，未注明的实施条件为常规实验中的条件。实施例1在2mL离心管中，依次加入975μL 100mM pH 8.0的磷酸盐缓冲溶液，加入底物5-氯-2,3-二氢-1-氧代-1H-茚-2-羧酸甲酯2mg，甲醇25μL，搅拌均匀后，加入不同的单加氧酶(来自苏州汉酶生物技术有限公司)2mg，NADP 2mg，葡萄糖3.2mg，葡萄糖脱氢酶2mg，30℃下震荡反应，24小时HPLC检测反应结果如表1。表1EW1531EW1535EW1536EW1538转化率33％48.3％47.3％43.9％产物ee96.1％96.7％92.5％100％从表1中可看出，在其他反应条件相同的情况下，采用牌号为EW1535的单加氧酶，底物的转化率最高，而采用牌号为EW1538的单加氧酶，产物e e值最高。实施例2在5mL离心管中，依次加入1950μL 100mM pH 8.0的磷酸盐缓冲溶液，加入底物5-氯-2,3-二氢-1-氧代-1H-茚-2-羧酸甲酯4mg，甲醇50μL，搅拌均匀后，加入单加氧酶EW 1538(来自苏州汉酶生物技术有限公司)1mg，NADP 0.5mg，葡萄糖6mg，葡萄糖脱氢酶1mg，不同温度下震荡反应，HPLC检测反应结果如表2。表2温度/℃2030401h27.9％24.5％7.0％3h57.5％67.6％7.5％24h67.6％71.4％7.6％从表2中可看出，在其他反应条件相同的情况下，在30℃温度条件下反应时，底物的转化率最高。实施例3在5mL离心管中，依次加入1950μL 100mM不同pH的缓冲溶液，加入底物5-氯-2,3-二氢-1-氧代-1H-茚-2-羧酸甲酯4mg，甲醇50μL，搅拌均匀后，加入单加氧酶EW1538(来自苏州汉酶生物技术有限公司)1mg，NADP 0.5mg，葡萄糖6mg，葡萄糖脱氢酶1mg，30℃下震荡反应，HPLC检测反应结果如本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种(S)‑5‑氯‑2,3‑二氢‑2‑羟基‑1‑氧代‑1H‑茚‑2‑羧酸甲酯的生物制备方法，其以5‑氯‑2,3‑二氢‑1‑氧代‑1H‑茚‑2‑羧酸甲酯为底物，该底物在生物催化剂、辅因子和辅因子再生系统的存在下，发生还原反应生成(S)‑5‑氯‑2,3‑二氢‑2‑羟基‑1‑氧代‑1H‑茚‑2‑羧酸甲酯，其特征在于，所述的生物催化剂为单加氧酶，所述的辅因子再生系统包括葡萄糖和葡萄糖脱氢酶，所述的还原反应在温度为20‑30℃、pH为7.0‑8.0的水相缓冲液中进行，在起始反应体系中，所述底物5‑氯‑2,3‑二氢‑1‑氧代‑1H‑茚‑2‑羧酸甲酯的浓度为15‑25 mg/mL，所述的单加氧酶与底物5‑氯‑2,3‑二氢‑1‑氧代‑1H‑茚‑2‑羧酸甲酯的质量比为1:1‑20。
【技术特征摘要】
1.一种(S)-5-氯-2,3-二氢-2-羟基-1-氧代-1H-茚-2-羧酸甲酯的生物制备方法，其以5-氯-2,3-二氢-1-氧代-1H-茚-2-羧酸甲酯为底物，该底物在生物催化剂、辅因子和辅因子再生系统的存在下，发生还原反应生成(S)-5-氯-2,3-二氢-2-羟基-1-氧代-1H-茚-2-羧酸甲酯，其特征在于，所述的生物催化剂为单加氧酶，所述的辅因子再生系统包括葡萄糖和葡萄糖脱氢酶，所述的还原反应在温度为20-30℃、pH为7.0-8.0的水相缓冲液中进行，在起始反应体系中，所述底物5-氯-2,3-二氢-1-氧代-1H-茚-2-羧酸甲酯的浓度为15-25 mg/mL，所述的单加氧酶与底物5-氯-2,3-二氢-1-氧代-1H-茚-2-羧酸甲酯的质量比为1:1-20。2.根据权利要求1所述的(S)-5-氯-2,3-二氢-2-羟基-1-氧代-1H-茚-2-羧酸甲酯的生物制备方法，其特征在于，所述的单加氧酶为购自苏州汉酶生物技术有限公司生产的牌号为EW1531、EW1535、EW1536或EW1538的单加氧酶中的一种或多种的组合。3.根据权利要求2所述的(S)-5-氯-2,3-二氢-2-羟基-1-氧代-1H-茚-2-羧酸甲酯的生物制备方法，其特征在于，所述的单加氧酶为购自苏州汉酶生物技术有限公司生产的牌号为EW1535的单加氧酶。4.根据权利要求1所述的(S)-5-氯-2,3-二氢-2-羟基-1-氧代-1H-茚-2-羧酸甲酯的生物制备方法，其特征在于，起始反应体系中，所述的葡萄糖：葡萄糖脱氢酶：5-氯-2,3-二氢-1-氧代-1H-...
【专利技术属性】
技术研发人员：陶军华，付敏杰，杨锴，
申请(专利权)人：苏州汉酶生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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