一种甲胎蛋白异质体的检测方法、检测试剂和检测试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种甲胎蛋白异质体的检测方法、所用试剂和检测试剂盒，本发明专利技术的检测方法包括以下步骤：步骤1，表面偶联抗AFP-L3抗体的磁微粒A的制备，和表面偶联AFP-L3抗原的磁微粒B的制备；步骤2，荧光标记的抗AFP-L3抗体的制备；步骤3，AFP-L3含量的检测：血浆或血清样品和磁微粒A反应，反应完毕将AFP-L3洗脱，加入荧光标记的抗AFP-L3抗体孵育，再加入磁微粒B继续孵育，然后磁性分离，用荧光分光光度计检测样品荧光值，计算样品中AFP-L3含量。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种医学检测方法，特别涉及一种AFP-L3磁微粒免疫荧光检测方法、以及AFP-L3磁微粒免疫荧光检测试剂和检测试剂盒。
技术介绍
原发性肝细胞癌(HCC)是我国常见的恶性肿瘤之一，死亡率高，在恶性肿瘤死亡顺位中仅次于胃癌、食道癌而居第三位，在部分地区的农村中则占第二位，仅次于胃癌。我国是乙肝大国，大约有1.2亿乙肝病毒携带者，每年有13万患者死于肝癌，占全世界肝癌死亡人数的45％。肝细胞癌大部分基于长期乙肝病毒导致的慢性肝炎、肝硬化。与其他肿瘤普查一样，肝癌防治主要在于“三早”，即早期发现、早期诊断和早期治疗。早期肝癌，除非位置特殊，治疗上多无太大困难，切除、栓塞、消融及肝移植等方法皆能奏效，如得到科学治疗，5年生存率在50～70％以上，大部分患者可以长期存活。然而中晚期肝癌通常伴有肝内外的转移，手术无法切除，也无法实施肝移植，介入栓塞治疗效果欠佳，药物治疗也难有显效，手术并发症多，疗效差，生存期短，一般发病后生存时间仅为6个月。临床肝癌疗效不尽如人意的最主要原因是临床确诊时已近晚期，因此对于肝癌，在亚临床阶段即可得出诊断非常重要。目前甲胎蛋白(AFP)已经被广泛应用于临床诊断。尽管AFP在很多的临床疾病中都有相应的升高，但它主要是作为临床诊断HCC的肿瘤标志物，其血清浓度可能与HCC的分化程度及肿瘤的大小相关。在高危人群中，15～58％的慢性肝炎患者和11～47％的肝硬化患者其血清中的AFP都会有所升高，临床上将ALT不升高，AFP升高作为肝细胞再生的指标。HCC和肝病患者血清中AFP均有升高，致使对AFP检测结果的解释产生混淆。从临床经验角度观察，AFP对HCC可疑患者(尤其是在高危人群中)的筛查是有效的，然而AFP特异性不足限制了HCC早期诊断的价值。AFP是一种糖蛋白，根据糖蛋白形式分三类：AFP-L1、AFP-L2、AFP-L3。AFP-L1主要存在于良性肝病中，AFP-L2来自孕妇，AFP-L3是肝癌细胞所特有，可以作为检测HCC的一个新的肿瘤标志物。研究表明，表达AFP-L3的肝癌细胞有早期血管浸润和肝内转移的倾向，在经过染色后通常在胞核中可发现Ki67，其为肝细胞恶变的一个标志物。如果α-连环蛋白缺失，那么HCC常常有肝外的转移。影像学研究发现AFP-L3阳性的HCC通常有丰富的肝动脉血液供给，肿瘤的倍增时间较短，提示AFP-L3阳性的HCC进程较快且容易发生早期转移。研究表明，若直径小于2cm的HCC患者血清中AFP-L3占总AFP的10％以上，那么提示此肿瘤具有攻击性癌变。在良性的肝脏慢性疾病中，肝
细胞不表达AFP-L3，因此AFP-L3的含量越高提示肿瘤的恶性程度越高。大量研究结果显示，AFP-L3与其组织器官来源有关，不同生理和病理状况可产生不同的糖链结构，具有相关肿瘤特异性；其单独或与其他肿瘤指标的联合应用，对于HCC的诊断疗效和预后判断具有重要意义。常彬霞等报道称表达AFP-L3的细胞有早期血管侵袭和肝内转移的倾向，约35％的直径<2cm的小肝癌病灶患者可出现AFP-L3的升高(常彬霞,辛邵杰.甲胎蛋白及其临床应用研究进展.世界华人消化杂志,2010；18:576-580)。食品药品监督管理局于2005年批准将该指标应用于肝癌诊断，并把AFP-L3诊断肝癌的阳性界定值为10％。AFP-L3在早期肝癌的预警方面也具有显著作用，研究表明其在肝癌术后预后判断具有重要的临床意义(Taketa K,Ichikawa E,Sakuda H,et al.Lectin reactivity of alpha-fetoprotein in a case of renal cell carcinoma.Tumour Biol,1989；10:275-280)(王寿明,高蕾,于乐成,何长伦.甲胎蛋白异质体对肝癌诊断及疗效评估价值研究进展.实用肝脏病杂志,2011；14:479-481)(陈燕,林莺莺,胡敏华,陈岩松.甲胎蛋白异质体在肝癌早期诊断和预警作用研究.现代肿瘤医学,2012；20:1652-1654)。由于AFP-L3来源于肝癌细胞的分泌，因此随着肿瘤直径的增加，其分泌到血中的AFP-L3含量也随之增多(李宾,刘志伟,刘艳芬,等.原发性肝癌患者术后甲胎蛋白异质体的变化及临床意义.贵阳中医药学报,2014；
36:52-54)。研究表明，AFP-L3≥10％作为肝癌的诊断标准敏感性为82.6％，与慢性肝病鉴别诊断的特异性为76.8％，肝癌患者的AFP-L3均值及阳性率均高于肝硬化组和慢性肝炎组，差别具有统计学意义，提示检测AFP-L3有助于鉴别原发性肝癌与非原发性肝癌患者。尤其在甲胎蛋白低浓度组AFP<400ng/ml，AFP-L3≥10％为鉴别诊断指标时，肝癌与良性肝病可得到明显区分(熊彪,蔡其浩,蒙凯.三项生化指标联合甲胎蛋白诊断原发性肝癌的研究.当代医学,2008；14(14):37-38)。Bae等指出，AFP-L3含量的测定有助于肝脏良恶性疾病的鉴别诊断。AFP-L3在良性慢性肝病患者很低，而在肝细胞癌(HCC)患者很高。另一方面，AFP-L3含量升高的患者，其HCC发生率也显著高于AFP升高的患者(BAE JS,PARK SJ,PARK KB,et al.Acute exacerbation of hepatitis in liver cirrhosis with very high levels of alpha-fetoprotein but no occurrence of hepatocellular carcinoma.Korean J Intern Med,2005；20(1):80-85)。血清AFP含量介于10～200ng/mL的患者，AFP-L3＞10％对HCC诊断的敏感度为71％，特异度为63％(王永忠,罗立波,吴国祥,等.微量离心柱法分离检测甲胎蛋白异质体(AFP-L3)及其临床意义.中华实验和临床病毒学杂志,2007；21(2):135-137)。AFP-L3＞35％对HCC诊断的敏感度为35％，特异度可达100％(STERLING RK,IEFFERS L,GORDON F,et al.Utility of Lens culinaris agglutinin-reactive fraction of alpha-fetoprotein and des-gamma-carboxy prothrombin,alone or in combination,as biomarkers for hepatocellular carcinoma.Clin Gastroenterol
Hepatol,2009；7(1):104-113)。临床一般以AFP-L3占AFP总水平的15％作为判断HCC的临界值，从而取得较好的特异度与敏感度性之间的平衡(LEERAPUN A,SURAVARAPU SV,B IDA JP,et al.The utility of Lens culinaris agglutinin2 reactive alpha2-fetoprotein in the diagno本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测血浆或血清中AFP‑L3含量的方法：所述方法包括以下步骤：步骤1，表面偶联抗AFP‑L3抗体的磁微粒A的制备，和表面偶联AFP‑L3抗原的磁微粒B的制备；步骤2，荧光标记的抗AFP‑L3抗体的制备；步骤3，AFP‑L3含量的检测：血浆或血清样品和磁微粒A反应，反应完毕将AFP‑L3洗脱，加入荧光标记的抗AFP‑L3抗体孵育，再加入磁微粒B继续孵育，然后磁性分离，用荧光分光光度计检测样品荧光值，计算样品中AFP‑L3含量。

【技术特征摘要】
1.一种检测血浆或血清中AFP-L3含量的方法：所述方法包括以下步骤：步骤1，表面偶联抗AFP-L3抗体的磁微粒A的制备，和表面偶联AFP-L3抗原的磁微粒B的制备；步骤2，荧光标记的抗AFP-L3抗体的制备；步骤3，AFP-L3含量的检测：血浆或血清样品和磁微粒A反应，反应完毕将AFP-L3洗脱，加入荧光标记的抗AFP-L3抗体孵育，再加入磁微粒B继续孵育，然后磁性分离，用荧光分光光度计检测样品荧光值，计算样品中AFP-L3含量。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述磁微粒A和磁微粒B的制备，方法如下：将磁微粒制备成磁微粒悬浮液，磁微粒悬浮液与抗AFP-L3抗体或AFP-L3抗原偶联：将抗AFP-L3抗体或AFP-L3抗原与磁微粒悬浮液混合孵育偶联，偶联后用封闭液封闭，得到偶联AFP-L3抗体的磁微粒A和偶联AFP-L3抗原的磁微粒B。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其中，所述与AFP-L3特异性结合的抗体是单克隆抗体或多克隆抗体。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其中，磁微粒与AFP-L3抗原的偶联条件选自如下条件：磁微粒粒径120nm、抗原浓度20μg/mL、22℃孵育2h、pH＝11；磁微粒粒径180nm、抗原浓度20μg/mL、22℃孵育2h、pH＝10；磁微粒粒径200nm、抗原浓度25μg/mL、25℃孵育4h、pH＝11；磁微粒粒径300nm、抗原浓度25μg/mL、25℃孵育4h、pH＝10；磁微粒粒径500nm、抗原浓度30μg/mL、28℃孵育6h、pH＝11；或者磁微粒粒径800nm、抗原浓度30μg/mL、28℃孵育6h、pH＝10。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其中，磁微粒与抗AFP-L3抗体的偶联条件选自如下条件：磁微粒粒径120nm、抗体浓度20μg/mL、22℃孵育2h、pH＝11；磁微粒粒径180nm、抗体浓度20μg/mL、22℃孵育2h、pH＝10；磁微粒粒径200nm、抗体浓度25μg/mL、25℃孵育4h、pH＝11；磁微粒粒径300nm、抗体浓度25μg/mL、25℃孵育4h、pH＝10；磁微粒粒径500nm、抗体浓度30μg/mL、28℃孵育6h、pH＝11；或者磁微粒粒径800nm、抗体浓度30μg/mL、28℃孵育6h、pH＝10。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤如下：步骤(1)取磁微粒，加入磁微粒体积2～50倍的洗涤缓冲液，混匀，然后在磁力架上磁性分离，弃上清液；重复上一步骤，然后将磁微粒在与其等量的偶联缓冲液中悬浮，得到磁微粒悬浮液；步骤(2)向抗AFP-L3抗体或AFP-L3抗原中加入体积0.01～1倍的步骤(1)处理的磁微粒悬浮液，加入偶联缓冲液，孵育，直至磁微粒偶联完全；磁性分离，保留磁微粒；磁微粒偶联结束后，加入封闭液混匀， 孵育，磁性分离，得到偶联AFP-L3抗体的磁微粒A和偶联AFP-L3抗原的磁微粒B；步骤(3)荧光标记的抗AFP-L3抗体的制备：抗AFP-L3抗体溶解于碳酸盐缓冲液中，荧光素溶解于DMSO中，将荧光素逐滴缓慢加入抗AFP-L3抗体溶液中，4℃避光搅拌12～20h，用G-25葡聚糖凝胶去除游离的荧光素；步骤(4)取待测样品，加入样品体积1～100倍的磁微粒A，于室温旋转孵育2～6h或者4℃孵育12～20h，使AFP-L3抗原抗体充分反应；置于磁力架上磁性分离，弃上清液，用洗涤缓冲液清洗磁微粒复合物，置于磁力架上磁性分离，弃上清液；加入与抗体等量的洗脱液，混匀，重悬磁微粒，室温孵育5min，置于磁...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘婕，吴文强，李国栋，
申请(专利权)人：福建广生堂药业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：福建;35