染色体着陆垫及相关用途制造技术

本发明专利技术提供了在宿主细胞中稳定整合和/或表达一种或多种重组多核苷酸的方法。所述重组多核苷酸通常被整合入宿主基因组中的一些天然染色体整合位点处。这些天然染色体整合位点位于CHO基因组的特定基因之内或附近，所述基因为锚蛋白2基因(Ank2)、切割和多腺苷酸化特异性因子4基因(Cpsf4)、C‑Mos基因和Nephrocystin‑1/Mal基因。还提供了将位点特异性重组序列(染色体着陆垫)插入到这些特定染色体位置的方法和核酸分子。进一步提供了含有整合入天然染色体整合位点的染色体着陆垫或转基因的工程化宿主细胞。进一步提供了用于在带有插入的染色体着陆垫的宿主细胞中整合和表达异源多核苷酸的方法和组合物。

【技术实现步骤摘要】
本申请是申请日为2012年4月5日、申请人为斯克利普斯研究所、专利技术名称为染色体着陆垫及相关用途”的中国专利申请201280025685.4的分案申请。对优先权文件的引用本申请根据35U.S.C.§119(e)要求2011年4月5日提交的美国临时专利申请序列号61/516,612的优先权。本申请要求上述提交日的优先权，上述临时专利申请的公开内容通过引用以其整体纳入本文。序列表的纳入本申请包括与纸质序列表对等的电子版序列表，通过EFS网站电子提交，还包括通过EFS网站电子提交的计算机可读形式的序列表，含有文件名为“37651505001WOSEQUENCELISTING.txt”的文件，该文件大小为213476字节，创建于2012年4月5日，这些序列表通过引用以其整体纳入本文。
本专利技术涉及在表达异源多核苷酸的方法，尤其涉及在宿主细胞中稳定整合并表达异源多核苷酸的方法。
技术介绍
出于治疗目的(例如，基因治疗)以及在体外生产有用的蛋白或多肽时，会常规地将异源多核苷酸整合到哺乳动物细胞的基因组中。通过非同源重组在基因组的随机位置插入需要几轮筛选和克隆扩增以产生可接受的表达系统。每次寻找针对新基因的表达系统时还需要重复这种方法。由于整合事件的随机性，插入了重组基因的一些位置根本不能支持转录事件。这是因为表达水平很大程度上受基因位点上局部遗传环境作用(位置作用)的影响。此外，来自很多染色体位点的表达随时间而减少。某些情况下，这种不稳定性是由于转基因的DNA甲基化。因此，根据整合的位点，整合的基因的表达水平可能有很大的差异。
此外，某些情况下，随机整合入基因组的外源DNA会打断重要的细胞基因，产生改变的表型。除随机插入以外，已描述了重组酶介导的整合，用于将转基因插入到基因组中的特定位点。然而，获得整合的转基因的稳定、高效表达仍然是很复杂和繁琐的，需要大量被筛选的克隆以选择所需的整合细胞。本领域需要用于在哺乳动物细胞中实现异源多核苷酸的稳定整合和/或高水平基因表达的方法。本公开解决了这一需要以及其它需要。
技术实现思路
一方面，本申请提供了用于在宿主细胞中稳定整合和表达异源多核苷酸的方法。所述方法包括将异源多核苷酸插入到宿主细胞基因组中位于选自下组的基因之内或附近的天然染色体位点处：锚蛋白2基因(Ank2)、切割和多腺苷酸化特异性因子4基因(Cpsf4)、C-Mos基因和Nephrocystin-1/Mal基因。一些方法中，用同源重组或杂合重组酶介导异源多核苷酸插入到宿主基因组中。一些方法中，宿主细胞是哺乳动物细胞，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。在一些此类方法中，天然染色体插入位点位于或靠近以下位置：Ank2基因SEQ ID NO:1的位置130-131，Cpsf4基因SEQ ID NO:2的位置629-630，C-Mos基因SEQ ID NO:3的位置272-273，或Nephrocystin-1/Mal基因SEQ ID NO:4的位置239-240。一些方法中，待整合到宿主基因组的异源多核苷酸可编码多肽，例如治疗性蛋白或工业蛋白。在相关方面，提供了用于将异源多核苷酸序列稳定整合到哺乳动物细胞基因组中的重组或工程化多核苷酸。所述重组多核苷酸通常含有第一同源臂、所述异源多核苷酸序列、和第二同源臂。所述第一和第二同源臂分别与侧接于位于选自下组的基因之内或附近的天然染色体插入位点的5’-和3’-序列基本相同：锚蛋白2基因(Ank2)、切割和多腺苷酸化特异性因子4基因(Cpsf4)、C-Mos基因和Nephrocystin-1/Mal基因。通常，所述天然染色体插入位点能够支持外来基因的稳定整合。一些方法中，异源多核苷酸序列编码多肽，例如治疗性蛋白或工业蛋白。一些其他方法中，异源多核苷酸序列含有位点特异性重组序列(染色体着陆垫(chromosomal landing pad))。例如，位点特异性重组序列可以是被噬菌体整合酶识别的识别序列，诸如被phiC-31噬菌体整合酶识别的attP位点
或attB位点。一些方法中，宿主哺乳动物细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。在这些方法中，天然染色体插入位点可位于或靠近以下位置：Ank2基因SEQ ID NO:1的位置130-131，Cpsf4基因SEQ ID NO:2的位置629-630，C-Mos基因SEQ ID NO:3的位置272-273，或Nephrocystin-1/Mal基因SEQ ID NO:4的位置239-240。相关实施方式中，本专利技术还提供了含有重组或工程化多核苷酸的载体。另一方面，提供了工程化的哺乳动物细胞。所述细胞携带有被稳定整合到其基因组中位于选自下组的基因之内或附近的一个或多个天然染色体插入位点处的异源多核苷酸：锚蛋白2基因(Ank2)、切割和多腺苷酸化特异性因子4基因(Cpsf4)、C-Mos基因和Nephrocystin-1/Mal基因。通常，所选的天然染色体插入位点支持外来基因的稳定整合。一些方法中，异源多核苷酸编码多肽，例如治疗性蛋白或工业蛋白。一些其他方法中，异源多核苷酸含有位点特异性重组序列(染色体着陆垫)。例如，位点特异性重组序列可以是被噬菌体整合酶识别的识别序列，诸如被phiC-31噬菌体整合酶识别的attP位点或attB位点。一些优选的实施方式涉及重组或工程化的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。在这些实施方式中，异源多核苷酸可优选整合在以下位置或以下位置附近：Ank2基因SEQ ID NO:1的位置130-131，Cpsf4基因SEQ ID NO:2的位置629-630，C-Mos基因SEQ ID NO:3的位置272-273，或Nephrocystin-1/Mal基因SEQ ID NO:4的位置239-240。在仍然另一个相关方面，提供将异源多核苷酸稳定整合到哺乳动物细胞基因组的方法。这些方法必需包括(a)将位点特异性重组序列插入到细胞基因组中，其中所述插入是在位于选自下组的基因之内或附近的天然染色体插入位点处：锚蛋白2基因(Ank2)、切割和多腺苷酸化特异性因子4基因(Cpsf4)、C-Mos基因和Nephrocystin-1/Mal基因；以及(b)通过同源重组将异源多核苷酸整合到细胞基因组中插入的位点特异性重组序列处。选择用于这些方法的天然染色体插入位点通常支持外来基因的稳定整合。一些方法中，位点特异性重组序列是被噬菌体整合酶识别的第一识别序列，例如phiC-31噬菌体整合酶的attP位点或attB位点。这些方法中，异源多核苷酸通常连接于噬菌体整合酶的第二识别序列，所述第二识别序列与所述第一识别序列例如被噬菌体整合酶识别的attB位点或attP位点是同族的(cognate)。一些方法中，使用的哺乳动物宿主细胞是中国仓
鼠卵巢(CHO)细胞。在这些方法中，位点特异性重组序列可优选被插入到基因组中的以下位置或以下位置附近：Ank2基因SEQ ID NO:1的位置130-131，Cpsf4基因SEQ ID NO:2的位置629-630，C-Mos基因SEQ ID NO:3的位置272-273，或Nephrocystin-1/Mal基因SEQ ID NO:4的位置239-240。一些方法中，本文档来自技高网...

【技术保护点】
在哺乳动物细胞中稳定整合并表达异源多核苷酸的体外方法，包括在天然染色体位点将所述异源多核苷酸插入到哺乳动物细胞基因组中，所述天然染色体位点位于以下位置或以下位置附近：i)中国仓鼠卵巢细胞中SEQ ID NO:2的位置629‑630，或其它哺乳动物细胞基因组中在切割和多腺苷酸化特异性因子4基因(Cpsf4)中对应于SEQ ID NO:2的位置629‑630的位置；ii)中国仓鼠卵巢细胞中SEQ ID NO:3的位置272‑273，或针对C‑Mos基因对应于SEQ ID NO:3的位置272‑273的位置；或者iii)中国仓鼠卵巢细胞中SEQ ID NO:4的位置239‑240，或在Nephrocystin‑1/Mal基因中对应于SEQ ID NO:4的位置239‑240的位置。

【技术特征摘要】
2011.04.05 US 61/516,6121.在哺乳动物细胞中稳定整合并表达异源多核苷酸的体外方法，包括在天然染色体位点将所述异源多核苷酸插入到哺乳动物细胞基因组中，所述天然染色体位点位于以下位置或以下位置附近：i)中国仓鼠卵巢细胞中SEQ ID NO:2的位置629-630，或其它哺乳动物细胞基因组中在切割和多腺苷酸化特异性因子4基因(Cpsf4)中对应于SEQ ID NO:2的位置629-630的位置；ii)中国仓鼠卵巢细胞中SEQ ID NO:3的位置272-273，或针对C-Mos基因对应于SEQ ID NO:3的位置272-273的位置；或者iii)中国仓鼠卵巢细胞中SEQ ID NO:4的位置239-240，或在Nephrocystin-1/Mal基因中对应于SEQ ID NO:4的位置239-240的位置。2.权利要求1的方法，其中所述异源多核苷酸的插入是由同源重组或由杂合重组酶介导的。3.权利要求1的方法，其中所述哺乳动物细胞是中国仓鼠卵巢细胞。4.权利要求1的方法，其中所述异源多核苷酸编码多肽。5.权利要求4的方法，其中所述多肽是治疗性蛋白或工业蛋白。6.用于将异源多核苷酸序列稳定整合到哺乳动物细胞基因组中的重组多核苷酸，含有：第一同源臂、所述异源多核苷酸序列、和第二同源臂；其中所述第一和第二同源臂分别与侧接于位于以下位置或以下位置附近的天然染色体插入位点的5’-和3’-序列至少80％相同：i)中国仓鼠卵巢细胞中SEQ ID NO:2的位置629-630，或其它哺乳动物细胞基因组中在切割和多腺苷酸化特异性因子4基因(Cpsf4)中对应于SEQ ID NO:2的位置629-630的位置；ii)中国仓鼠卵巢细胞中SEQ ID NO:3的位置272-273，或针对C-Mos基因对应于SEQ ID NO:3的位置272-273的位置；或者iii)中国仓鼠卵巢细胞中SEQ ID NO:4的位置239-240，或在Nephrocystin-1/Mal基因中对应于SEQ ID NO:4的位置239-240的位置。7.权利要求6的多核苷酸，其中所述天然染色体插入位点支持外来基因的稳定整合。8.权利要求6的多核苷酸，其中所述异源多核苷酸序列编码多肽。9.权利要求8的多核苷酸，其中所述多肽是治疗性蛋白或工业蛋白。10.权利要求6的多核苷酸，其中所述异源多核苷酸序列包含位点特异性重组序列，即染色体着陆垫。11.权利要求10的多核苷酸，其中所述位点特异性重组序列是被噬菌体整合酶识别的识别序列。12.权利要求11的多核苷酸，其中所述噬菌体整合酶是phiC-31整合酶。13.权利要求11的多核苷酸，其中所述识别序列是被所述噬菌体整合酶识别的attP位点或attB位点。14.权利要求6的多核苷酸，其中所述哺乳动物细胞是中国仓鼠卵巢细胞。15.包含权利要求6的重组多核苷酸的载体。16.工程化的哺乳动物细胞，包含在一个或多个天然染色体插入位点稳定整合到其基因组中的异源多核苷酸，所述一个或多个天然染色体插入位点位于以下位置或以下位置附近：i)中国仓鼠卵巢细胞中SEQ ID NO:2的位置...

【专利技术属性】
技术研发人员：V·P·莫罗，周伟，B·坎宁安，G·M·伊德尔曼，
申请(专利权)人：斯克利普斯研究所，
类型：发明
国别省市：美国;US