本发明专利技术公开了一种基于MLPA技术原理的基因拷贝数变异和基因突变的高通量测序检测技术，属于基因检测技术领域。在MLPA技术环节中，对PCR扩增环节或其前后环节进行改造，使PCR产物带有可进入高通量测序的接头序列并上机测序。对所得数据分析后获得每个探针扩增的Reads数，进以计算模板拷贝数或基因突变情况。该技术无需通过毛细管电泳区分不同长度的片段，产物设计可近乎一样长，因而可大大突破MLPA每次只能检测50多个位点的限制，并避免长探针制备的复杂步骤。接头序列中可置入用于区分不同样本的标签序列，因而本技术在确保检测拷贝数的高精确性的同时，实现了检测位点的高通量性和检测样本的高通量性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术总体涉及生物样本中的核酸分析领域，特别是利用基于多重连接的方法和高通量的方法检测遗传变异，属于基因检测
技术介绍
1 拷贝数变异概述[1]1.1 拷贝数变异（CNV）的发现拷贝数变异（copy number variations，CNVs）是指与参考序列相比，发生在基因组上的长度大于 1 kb 的 DNA 片段由于重复、缺失等原因造成的微结构变异[2]。1936年，Bridge在研究果蝇复眼性状时发现Bar基因中存在片段重复现象，从而影响了果蝇复眼的形成。而后在人类的一些疑难病基因中也相继发现了类似 Bar 基因的“重复”（Buckland PR. Polymorphically duplicated genes: their relevance to phenotypic variation in humans. Ann Med. 2003, 35: 308-315）。但大规模系统地对 CNV 开展研究始于 2004 年 Iafrate 和 Sebat 等分别发表在Nature 和 Science 上的研究成果。Iafrate 等在健康个体基因组中检测到了255个重复/缺失位点[3]。而 Sebat 的研究团队则在健康个体的基因组中发现了 221 个拷贝数变异位点[4]。这些研究表明，不仅在患病人群的基因组中能发现拷贝数变异，在健康人群中也发现基因拷贝数变异普遍存在，并可能对一些正常个体的表型产生影响。Redon 等利用微阵列比较基因组杂交（array-based Comparative Genome Hybridzation，aCGH）芯片在全基因组水平对来源于不同地域不同人种的 270 个个体进行检测，共鉴定到 1447 个拷贝数变异区域（Copy Number Variation Region，CNVR），整个区域覆盖约 12%的人类基因组序列，涉及基因近 2900 个。同时，公布了第一张人类 CNV 图谱。该研究表明 CNV 在基因组中广泛分布，并为之后在全基因组范围内进行大规模的 CNV 研究提供了基础[5]。1.2 CNV 的形成机制CNV 的主要类型是大片段的 DNA 重复和缺失， CNV 形成机制主要有以下四种：（1）非等位基因同源重组（Non-Allelic Homologous Recombination, NAHR）；（2）非同源末端连接（Non-Homologous End-Joining, NHEJ）；（3）复制叉延迟和模板转换模型（Fork Stalling and Template Switching, FoSTeS）；（4）L1 元件逆转录转座（L1 element Retrotransposition）。1.3 CNV 的作用机制拷贝数变异对基因和表型产生影响的主要机制为：（1）基因的剂量效应，比如表达增加或减少；（2）位置效应，通过改变调控元件与目的基因的距离改变基因的表达，或直接减少调控元件来影响基因表达；（3）基因的融合，融合两个相邻基因导致形成新的转录本或有功能的基因；（4）基因阻断，外显子结构变异同城导致基因失活；（5）潜在的缩并效应，通过基因座间的配对来影响基因的表达，这是反式调节的主要机制；（6）隐性位点或功能性多态位点的暴露。1.4 全基因组范围 CNV 检测方法目前，针对全基因组范围内 CNV 的检测方法主要包括微阵列比较基因组杂交技术（array-based comparative genomic hybridization，aCGH）、SNP 芯片技术和第二代测序技术（Next-Generation Sequencing，NGS）等。（1）aCGH 分析技术微阵列比较基因组杂交技术（aCGH）是基于微阵列技术的比较基因组杂交技术，在一张芯片上将标记不同荧光素的样品（试验样本和对照样本）同时进行杂交，将DNA 探针微量点样或原位合成到芯片上的各个位置，使检测的通量大幅度提高[6]。随着生物技术的发展，aCGH 方法对检测基因组中的重复和缺失越来越高效，成为早期全基因组 CNV 检测的主要方法。（2）SNP 芯片分析技术SNP 芯片是传统的 SNP 凝胶分型技术与生物芯片技术相结合的产物。在检测的过程中，待测 DNA 分子经过酶切并被荧光染料标记后与芯片上的探针序列进行杂交，然后利用激光扫描成像，根据图像中荧光信号的强弱来分析待测 DNA 分子与探针的杂交程度，从而鉴定待测序列上是否存在重复或缺失的变异。通常，根据 SNP芯片是否有连续的探针出现杂交信号增加或信号缺失来鉴别 CNV 是否存在。SNP芯片的局限性是，在覆盖基因组的时候通常偏向于已知的 SNP [7]。（3）高通量测序技术高通量测序也叫第二代测序技术（NGS），是在 Sanger 测序的基础上发展而来的。其采用高通量微阵列技术，可以同时分析大量样品的 DNA 片段（reads）。在分析的过程中，待测DNA 片段在连接酶或聚合酶的催化作用下不断延伸，边合成边测序是其特点，通过采集测序循环中产生的荧光信号或者氢离子信号来获得测序结果。第二代测序技术通过比较待测序列与参照序列在同一区域内的 reads 覆盖度来测定 CNV。检测步骤大致可以分为 5 步：（a）制备参照 DNA 样品和待测 DNA 样品；（b）对 DNA 样品进行测序：将 DNA 样品随机打断为固定长度的片段，片段两端连接接头序列，利用接头引物对 DNA 片段（reads）进行合成与测序；（c）计算相应的片段化序列在模板上的覆盖程度；（d）比较待测序列与参照序列在同一区域内的 reads 覆盖度，从而推断出该区域内 DNA 是否存在 CNVs；（e）检测结果的输出[8]。使用高通量测序的方法，如测序深度较深，则成本很高；如测序深度较低，则对较短片段拷贝数变异的检测能力降低。因此这是一种不太经济的技术方案。1.5局部已知 CNV 检测方法与全基因组检测方法相比，局部已知 CNV 的检测方法主要分为基于 PCR 技术和基于杂交技术两类。基于 PCR 技术的检测方法主要有三种：（1）荧光实时定量 PCR（Real-time quantitative PCR，qPCR）qPCR 方法是改进于常规 PCR 技术，在反应体系中加入了SYBR Green荧光染料或TaqMan荧光标记的探针，通过实时监控荧光信号，经过计算可获得扩增循环数（Ct 值）-荧光值的函数图像，再将待测基因的图像与对照基因的图像进行比较，即可计算出待测 DNA 初始模板量。利用 qPCR 技术检测 CNV 的理论基础则是对待测样本的目的基因（含有拷贝数多态）以及内参基因（2 个拷贝，无拷贝数多态）采用相对定量分析法进行分析[9]。该方法每次只能检测一个或少数几个位点。（2）多重连接依赖式探针扩增技术（multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA）MLPA 的基本原理是针对目标基因的序列设计相应的上游杂交探针和下游杂交探针(探针中置入通用引物)，分别杂交于 DNA 上相邻的部位。当杂交探针与基因组 DNA 充分杂交后，通过连接酶的连接反应即可将上游探针和下游探针连接形成一本文档来自技高网...
【技术保护点】
本专利技术公开了一种基于MLPA技术原理的基因拷贝数变异和基因突变的高通量测序检测技术；包含以下三个要素的技术方案，为本权利要求书的权利要求所覆盖：要素一，技术方案中用到了MLPA技术的原理；要素二，对经典MLPA技术方案中的一个或几个环节做了适应于高通量测序要求的技术改造；要素三，使用了高通量测序技术。
【技术特征摘要】
1.本发明公开了一种基于MLPA技术原理的基因拷贝数变异和基因突变的高通量测序检测技术；包含以下三个要素的技术方案，为本权利要求书的权利要求所覆盖：要素一，技术方案中用到了MLPA技术的原理；要素二，对经典MLPA技术方案中的一个或几个环节做了适应于高通量测序要求的技术改造；要素三，使用了高通量测序技术。2.根据权利要求1中所述的要素一，其特征在于，技术方案中用到了MLPA技术的核心环节；MLPA的整个环节包括：环节1，MLPA反应管中包含多种特异性探针，每个探针包括两个寡核苷酸片段，可称为上游探针和下游探针，这些寡核苷酸片段可以化学合成，也可以由M13噬菌体衍生法制备，也可以由其它方法获取；某些检测用到了三条或三条以上的寡核苷酸片段共同构成一个探针的组分，也应视为MLPA技术，以下相同；环节2，每个探针的寡核苷酸片段都包括一段靶核苷酸特异性序列和一段通用的引物序列；环节3，在MLPA反应中，一个探针的两个寡核苷酸片段分别杂交于 DNA 上相邻的部位，连接酶连接两个寡核苷酸片段；环节4，连接反应完成后，再使用一对通用引物对连接好的完整的探针进行多重扩增；环节5，连接好的探针的最终扩增产物的数量，可反映靶序列的数量或基因变异情况；环节6，对于最终扩增产物，通过一定的检测技术手段进行检测，然后使用计算公式或软件定量或半定量地推导出靶序列的数量；以上整个环节中，环节1到环节4是MLPA技术的核心环节，是该技术区别于其它技术的关键；用到了环节1到环节4的步骤的技术方案，即视为用到了MLPA的技术原理。3.根据权利要求1中所述的要素二，其特征在于，所谓经典的MLPA技术方案，包括以Holland-MRC公司为代表的公司开发的数百种MLPA试剂盒用的技术方案，也包括在此技术上开发的衍生技术方案，如在每个反应管中添加三条或三条以上的通用引物，以便同时使用2种或2钟以上的荧光标记，以及其它同样具有权利要求2中“MLPA技术的核心环节”所述特征的技术方案；对这些经典MLPA技术方案进行的以二代测序为导向的技术改造包括但不限于以下环节：环节一, 经典的MLPA技术的反应管中包含多种特异性探针，每个探针包括两个寡核苷酸片段；每个寡核苷酸片段都包括一段靶核苷酸特异性序列和一段通用的引物序列；将通用引物序列更换或增加为高通量测序用的接头序列 [接头包括与流路池（flow cell）结合的序列，连接了接头的DNA片段进行PCR扩增所需的引物结合序列，高通量测序引物结合序列，包括或不包括用于区分不同样本的标签（indexing or barcoding）序列等；Illumina公司提供的典型的接头序列为：TruSeq Universal Adapter: 5’- AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT -3’；TruSeq Indexed Adapter：5’- GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC‐NNNNNN‐ATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG -3’]，使得与待测核酸靶序列杂交、连接反应完成后，可进行用于建库的LM-PCR(Ligation Mediated PCR)反应，该PCR同时也起到了MLPA中一对引物多重扩增的作用；接头序列中高通量引物结合序列则可用于上机后高通量测序；环节二：包含有一段靶核苷酸...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨永臣，
申请(专利权)人：杨永臣，
类型：发明
国别省市：上海;31
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