氨基酸衍生物制造技术

本发明专利技术提供了可用于生物偶联过程中的式(X)、(I)、(II)、(V)、(VI)、(VII)和(VIII)的吡咯赖氨酸类似物，其中a、b、d、X、Y、Z、FG、R、R1、R2和R3是如权利要求书中所定义的；以及含有这些吡咯赖氨酸类似物的突变体蛋白。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】本专利技术涉及用于生物偶联过程中的氨基酸衍生物。引言吡咯赖氨酸是由琥珀密码子可靠地指定的唯一一种天然氨基酸。其使用天然进化成正交于所有其他氨基酸和tRNA的第21个氨基酰基-tRNA合成酶(PylRS)。布莱特(Blight)等人，2004显示在大肠杆菌(E.coli)中，PylRS和其对应部分tRNA(tRNApyl)可在琥珀密码子处纳入吡咯赖氨酸。其还表明wt PylRS是天然混杂的且可纳入赖氨酸的类似物。横山(Yokoyama)等人(EP 1911840)展示，PylRS/tRNApyl系统在真核细胞中是正交的，且显示在细菌细胞中将若干非天然氨基酸(nnAA)纳入由琥珀密码子编码的靶蛋白中。这些作者还鉴定了pylRS中形成氨基酸结合口袋且起到相对于其他典型氨基酸选择吡咯赖氨酸的作用的关键氨基酸残基。此位点处的突变生成能够识别tRNApyl且用AzZ-lys将tRNApyl氨基酰化的突变体(柳泽(Yanagisawa)，2008)。这种正交性延伸到细菌和真核细胞。PylRS是天然混杂的合成酶，其已经天然进化以排除赖氨酸，但将在不突变的情况下纳入赖氨酸类似物，包括叠氮化物、炔烃和烯烃(柳泽等人，2008；诺伊曼(Neumann)等人，2008；向井(Mukai)等人，2008；阮(Nguyen)等人，2009)。这种特异性的基础取决于在pylRS结合口袋的氨基酸残基之间的疏水性相互作用，其中吡咯赖氨酸的吡咯环使该氨基酸稳定并且将该氨基酸正确地定位在该合成酶的活性位点中(卡佛兰(Kavran)等人，2007)。此RS/tRNA对已通过瞬时转染引入细菌、酵母和哺乳动物细胞中，且已显示可有效地将多种非天然氨基酸纳入靶蛋白中。例如，EP 1911840展示在大肠杆菌细胞中将Ν-ε-boc-赖氨酸纳入靶蛋白中。在过去几年中，例如费克纳(Fekner)等人(费克纳、李(Li)和成(Chan)，2010)和刘(Liu)等人已揭示并综述吡咯赖氨酸类似物，其定义为由天然或以遗传方式进化的PylRS识别且在琥珀密码子位点处纳入蛋白质中的氨基酸衍生物。具有官能团或翻译后修饰的类似物已使用pylRS-tRNApyl系统以位点特异性方式纳入蛋白质中。若干研究(参见例如柳泽等人)关注PylRS酶内的突变以适应其中N6取代基为结合口袋吡咯赖氨酸内的芳香族环的类似物。其他研究(例如阮等人(也在WO 2010/139948中)和李等人(也在WO 2011/044255中))关注不携载庞大N6取代基的吡咯赖氨酸类似物的鉴定，其中结果是获得将易于合成且与天然pylRS/tRNApyl对相互作用的较简单类似物。此外，秦(Chin)等人研发出两种具有末端炔和叠氮化物基团的类似物，其适用于通过铜催化的点击化学(CUAAC)进行蛋白质标记。业内仍需要研发出其他吡咯赖氨酸类似物。尽管迄今为止所制得的吡咯赖氨酸类似物限于从赖氨酸骨架演变来的那些，但本专利技术者已成功地自多种氨基酸结构开始利用天然pylRS/tRNApyl对生成纳入蛋白质中的吡咯赖氨酸类似物
技术实现思路
：本专利技术提供如本文所述式I至VIII的吡咯赖氨酸类似物。本专利技术还提供含有作为非天然氨基酸的一种或多种(例如一种)如本文所述式I至VIII的吡咯赖氨酸类似物的突变体蛋白。本专利技术还提供如前所述的突变体蛋白，其通过一种或多种(例如一种)非天然氨基酸偶联至一个或多个(例如一个)选自蛋白质、细胞毒性剂、药物和聚合物的部分。本专利技术还提供使用如前所述的吡咯赖氨酸类似物制造含有一种或多种非天然氨基酸的突变体蛋白。本专利技术所述的氨基酸类似物是新颖且有用的，且其在容易纳入蛋白质(在适当使用时通常不损失生物活性)中并提供有用的生物偶联方式方面具有直接制备的优势。图式简单说明图1：含有叠氮化物的单克隆抗体的聚乙二醇化。泳道1：含有纳入重链中且经受聚乙二醇化条件的式IA.1类似物的抗体；泳道2：含有纳入重链中且经受聚乙二醇化条件的式III.1类似物的抗体。序列表简单说明SEQ ID No 1：PylRS马氏甲烷八叠球菌(Methanosarcina mazei)WT核苷酸序列SEQ ID No 2：PylRS马氏甲烷八叠球菌WT氨基酸序列SEQ ID No 3：PylRS马氏甲烷八叠球菌Y384F突变体核苷酸序列SEQ ID No 4：PylRS马氏甲烷八叠球菌Y384F突变体氨基酸序列SEQ ID No 5：tRNApyl马氏甲烷八叠球菌Go1SEQ ID No 6：U6snRNA启动子SEQ ID No 7：U6-tRNApyl构建体SEQ ID No 8：GFP核苷酸序列SEQ ID No 9：GFP氨基酸序列SEQ ID No 10：GFPY40核苷酸序列SEQ ID No 11：GFPY40氨基酸序列SEQ ID No 12：抗Her2(4D5)γ核苷酸序列SEQ ID No 13：抗Her2(4D5)γ氨基酸序列SEQ ID No 14：抗Her2(4D5)γ_K274琥珀核苷酸序列SEQ ID No 15：抗Her2(4D5)γ_K274琥珀氨基酸序列SEQ ID No 16：抗Her2(4D5)κ核苷酸序列SEQ ID No 17：抗Her2(4D5)κ氨基酸序列实施方式定义术语“酰胺”是指-C(＝O)-NH-键。术语“氨基甲酸酯”是指-O-C(＝O)-NH-键。术语“酯”是指-C-C(＝O)-O-C键。术语“烷基”是指通常含有1至6个、例如1至4个碳原子且可为直链或具支链的脂肪族键或取代基。实例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基和叔丁基。术语“烷氧基”是指基团-O-烷基。术语“烯基”、“烯烃”或“烯烃”是指通常含有2至6个、例如2至4个碳原子且可为直链或具支链并因含有至少一个C＝C部分而为不饱和的脂肪族键或取代基。实例包括乙烯基、丙烯-1-基、丙烯-2-基和2-甲基-丙烯-2-基。烯基可任选地经例如一个或多个(例如1个)诸如卤素(例如Cl)或醚基(例如-O-C1-6烷基)等取代基取代，但适宜地其不经取代。术语“炔基”或“炔烃”是指通常含有2至6个、例如2至4个碳原子且可为直链或具支链并因含有至少一个C≡C部分而为不饱和的脂肪族键或取代基。实例包括-C≡CH和-C≡C-CH3。炔基可任选地经例如一个或多个(例如1个)诸如卤素(例如Cl)或醚基(例如-O-C1-6烷基)等取代基取代，但适宜地其不经取代。术语“环烷基”是指通常含有3至8个环碳原子的脂环族不饱和化合物。环烷基可含有支链。碳原子总数通常将为3至10。实例性基团包括环丙基、环丁基、环戊基、3-甲基-环丙基和环己基。术语“环烯基”是指通常含有5至8个环碳原子且含有至少一个C＝C部分的脂环族化合物。环烯基可含有支链。碳原子总数通常将为5至10。实例性基团包括环戊烯基、3-甲基-环丙烯基和环己烯基。术语“杂环基”是指其中环含有一个或多个(例如一个、两个或三个，例如一个或两个，尤其一个)选自O、N和S的杂原子的环烷基或环烯基部分。实例包括氮杂环丁烷、吡咯烷、哌啶、哌嗪、N-甲基哌嗪、吗啉和硫吗啉。术语“芳基””是指可为键的一部分或取代基的一部分的芳香族环结构。芳基部分可含有一个环(例如苯基)或两个环(例如萘基)。芳基可经例如一个本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种式X的吡咯赖氨酸类似物：其中X＝O或S；Y＝CH2、NH、O或S；Z＝CH2、CH‑NH2、CH‑OH、NH、O或S；FG＝叠氮化物、烯烃、炔烃、酮、酯、芳基或环炔烃；a＝整数1至7；b＝整数1至7，只是当Z是NH、O或S时，则b是整数2至7；条件是a+b介于2至8范围内；且d＝整数1至4。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.08.05 US 61/862,4971.一种式X的吡咯赖氨酸类似物：其中X＝O或S；Y＝CH2、NH、O或S；Z＝CH2、CH-NH2、CH-OH、NH、O或S；FG＝叠氮化物、烯烃、炔烃、酮、酯、芳基或环炔烃；a＝整数1至7；b＝整数1至7，只是当Z是NH、O或S时，则b是整数2至7；条件是a+b介于2至8范围内；且d＝整数1至4。2.根据权利要求1所述的吡咯赖氨酸类似物，是式III的吡咯赖氨酸类似物：其中a、b、Y、Z、d和FG是如权利要求1中所定义的。3.根据权利要求2所述的吡咯赖氨酸类似物，其选自4.根据权利要求1所述的吡咯赖氨酸类似物，是式IV的吡咯赖氨酸类似物：其中a、b、Y、Z、d和FG是如权利要求1中所定义的。5.根据权利要求4所述的吡咯赖氨酸类似物，其选自6.一种式I的吡咯赖氨酸类似物：其中Z＝键、CH2、CH-NH2、CH-OH、NH、O、S或CH-NH2；a是整数3至7；b是0或整数1至7；且FG＝叠氮化物、烯烃、炔烃、酮、酯、芳基或环炔烃；其前提是：当a表示4且Z表示O时，-(CH2)b-FG不表示-CH2-C＝CH、-CH2CH2-N3、-CH2-CH＝CH2或-CH2-Ph；当a表示4且Z表示O时，-(CH2)b-FG不表示-CH2CH2CH2-C(＝O)CH3或-CH2CH2CH2-CH＝CH2；当a表示4、Z表示键且b表示0时，-(CH2)b-FG不表示-C(＝O)Bn或-C(＝O)Me；且当a表示4且Z表示键时，-(CH2)b-FG不表示-CH2CH2-C≡CH。7.根据权利要求6所述的吡咯赖氨酸类似物，其中a是3。8.根据权利要求6所述的吡咯赖氨酸类似物，其中a是4。9.根据权利要求6到8中任一项所述的吡咯赖氨酸类似物，其中Z是O。10.根据权利要求6到8中任一项所述的吡咯赖氨酸类似物，其中Z是N。11.根据权利要求6到8中任一项所述的吡咯赖氨酸类似物，其中Z是键。12.根据权利要求8所述的吡咯赖氨酸类似物，其选自13.根据权利要求7所述的吡咯赖氨酸类似物，其选自14.一种式II的吡咯赖氨酸类似物：其中Z＝CH2、CH-NH2、CH-OH、NH、...

【专利技术属性】
技术研发人员：M·马瑞利，M·V·布伦特，K·H·格拉布斯坦，
申请(专利权)人：米迪缪尼有限公司，
类型：发明
国别省市：英国;GB