本发明专利技术涉及生物工程技术领域，具体涉及一种用于哺乳动物体细胞核移植的融合装置，上述融合装置，包括辅助融合皿和融合槽，所述的辅助融合皿为平面盘状器皿，在所述的辅助融合皿中液体可形成液滴；所述的融合槽中固定有电融合电极，所述的电融合电极与电融合仪相连；所述的辅助融合皿与融合槽的相对位置固定。装置结构简单，成本较低，利用上述融合装置进行融合，操作简便、快速，在一台体式显微镜下可实现供体细胞‑受体细胞复合体的制备和融合的操作，降低了设备投入；受体细胞与供体细胞形成复合体后可立即进行融合，缩短了细胞融合操作时间，降低了对细胞的潜在损伤和重构胚的存活压力，融合效率接近100％。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物工程
，具体涉及一种用于哺乳动物体细胞核移植的融合装置。
技术介绍
动物克隆技术是将供体体细胞核经显微手术和/或细胞融合的方法移植到去核卵母细胞胞质中，重新组成胚胎(重构胚)。重构胚经培养发育至囊胚，再将囊胚移植到同步发情的寄母子宫内，待发育成熟后分娩出动物，该动物被称为“克隆动物”，该技术则被称为“体细胞克隆技术”或“体细胞核移植技术”。在动物的细胞核移植操作中，将供体细胞的细胞核导入卵母细胞质中的过程称为融合，目前动物克隆中普遍采用的融合方法是电介导融合的方法。如专利CN201010201828.5公开了一种藏羚羊-山羊种间克隆胚胎构建与体外培养的方法，其中，融合操作包括：首先，将供体细胞培养在24孔板中；然后，先将受体卵母细胞移至T20微滴内，再移一个受体卵母细胞至植物血凝素微滴内，然后转移到T2B微滴中粘取一个供体细胞，再重新转移至植物血凝素微滴中，再从T20微滴中移一个受体卵母细胞至植物血凝素微滴中，形成两个卵母细胞夹杂一个供体细胞的复合体；将复合体移至融合液滴内平衡2-3min后，再至融合槽内以交流电场7V，脉冲电场70V，持续时间20μs，持续两次，每次间隔0.1s进行电融合。上述专利中得到的山羊的去核卵数为83个，复圆卵数为68个，复圆率为82.27％。在体细胞和去核卵细胞进行电融合时，常常需要使用两台体式显微镜分别用来放置体细胞和融合槽以便观察体细胞和卵母细胞的复合体的形成情况和细胞的融合情况，设备投入较高；另外，整个融合操作流程繁琐，完成细胞融合耗用时间较长，融合效率较低。
技术实现思路
为克服现有技术的不足，本专利技术提供一种用于哺乳动物体细胞核移植的融合装置，包括辅助融合皿和融合槽，所述的辅助融合皿为平面盘状器皿，在所述的辅助融合皿中液体可形成液滴；所述的融合槽中固定有电融合电极，所述的电融合电极与电融合仪相连；所述的辅助融合皿与融合槽的相对位置固定。优选的，融合槽固定于辅助融合皿的上方一侧，融合槽未将辅助融合皿上方完全覆盖，便于受体细胞结合供体细胞制备复合体的操作进行；优选的，所述的辅助融合皿与融合槽的相对位置固定可通过粘合剂粘结、用其他物体卡顶、将二者分别固定在一个物体上等方式实现；进一步优选的，上述融合装置中还包括一个固定支持器皿，所述的辅助融合皿和融合槽置于固定支持器皿中并分别固定，实现二者的相对位置固定；更优选的，所述的固定支持器皿为平面盘状器皿；优选的，所述的液体为进行细胞融合操作所需的试剂液体，包括：培养液、融合液和PHA(植物凝集素)；优选的，所述的液滴用矿物油覆盖，防止液滴蒸发和位置移动；优选的，所述的辅助融合皿中可包含凹坑，用于放置液滴，可保证液滴的位置不发生移动和便于标记区分，凹坑的个数根据融合所需液滴的数量确定；优选的，所述的辅助融合皿、平面皿、融合槽的材质可为玻璃或塑料，可一次性使用或多次使用；所述的电融合电极为市售产品，如BTX电融合电极；在本专利技术的一个具体实施方式中，所述的辅助融合皿和固定支持器皿为培养皿，且固定支持器皿的直径大于辅助融合皿的直径和融合槽的长度；上述融合装置中，包括至少一个辅助融合皿和至少一个融合槽，辅助融合皿和融合槽的个数可根据融合细胞的数量调整。在本专利技术的一个具体实施方式中，所述的用于哺乳动物体细胞核移植的融合装置包括辅助融合皿、融合槽和固定支持器皿，所述的辅助融合皿为培养皿盖，在所述的辅助融合皿中液体可形成液滴；所述的融合槽中固定有电融合电极，所述的电融合电极与电融合仪相连；所述的固定支持器皿为直径大于辅助融合皿和融合槽的培养皿盖；所述的辅助融合皿和融合槽置于固定支持器皿中并分别固定，且融合槽在辅助融合皿上方一侧，电极用融合液覆盖。本专利技术还提供一种用于哺乳动物体细胞核移植的融合方法，其具体步骤包括：(1)在上述融合装置的辅助融合皿中，将培养液、融合液和PHA分别制成液滴；将融合槽的电极用融合液覆盖；(2)将供体细胞置于辅助融合皿的培养液液滴中；(3)将受体细胞置于辅助融合皿的PHA液滴中，取出后，移至步骤(2)得到的培养液液滴中进行配对；(4)将步骤(3)配对后形成的受体细胞-供体细胞的复合体置于融合液液滴中平衡；(5)将步骤(4)得到的受体细胞-供体细胞的复合体移入融合槽内进行电融合。优选的，步骤(1)中，PHA、培养液和融合液的液滴数量比为1:1-10:1-10，进一步优选为1:1-10:1-5；具体液滴数量根据融合细胞的数量确定；优选的，步骤(2)中用于放置供体细胞的培养液滴与步骤(4)中平衡用的融合液滴配对排列，便于区分和操作；优选的，步骤(3)中所述的受体细胞置于PHA液滴中的时间为1-10秒，优选为1-5秒，更优选为2秒；优选的，步骤(4)中所述的受体细胞-供体细胞的复合体在融合液液滴中平衡时间为1-20秒，优选为2-15秒，更优选为5-10秒；优选的，步骤(5)的融合槽中，受体细胞与供体细胞成一直线且该直线垂直于融合槽电极；优选的，步骤(5)中的电融合的参数为：交流电压为2V，脉冲电压为50-200V，更优选为80-150V，进一步优选为100V；脉冲宽度为1-20μs，更优选为5-10μs，进一步优选为9μs；脉冲次数为1-5次，更优选为1次；优选的，所述的融合方法还包括将融合槽中经过电融合的受体细胞-供体细胞的复合体置于培养液液滴中，在体式显微镜下观察融合情况；优选的，所述的受体细胞为去核的哺乳动物卵母细胞；优选的，所述的供体细胞为成纤维细胞，进一步优选胎儿成纤维细胞；所述的受体细胞和供体细胞取自相同或不同种的哺乳动物，优选为取自同种哺乳动物；优选的，所述的哺乳动物选自：牛、马、羊、猪、鼠、猫或兔；进一步优选的，所述的哺乳动物选自：牛、羊、猪；更优选的，所述的哺乳动物为牛；优选的，所述的去核的哺乳动物卵母细胞通过以下步骤得到：将哺乳动物卵母细胞经过显核处理、透明带消化，卵母细胞表面形成微小的突起，在体式显微镜下，以卵母细胞表面突起为标识，切除靠近突起的部分卵母细胞质，得到去核的卵母细胞；所述的培养液选自：RPMI-1460、DMEM、MEM、M199、F-10、F-12、DMED/F-12 1:1、McCoy‘s 5A等细胞培养基；所述的融合液为含有0.2-0.5mmol/L的甘露醇、0.05-0.20mmol/L的CaCl2·2H2O、0.05-0.20mmol/L的MgCl2·6H2O和0.5-2.0mmol/L的4-羟乙基哌嗪乙磺酸的0.01％聚乙烯醇(W/V)；本专利技术还提供一种上述融合方法在哺乳动物体细胞核移植中的应用。优选的，所述的融合方法在哺乳动物体细胞核移植中的应用，其具体步骤如下：(1)准备受体卵母细胞：取经过体外成熟培养并移除卵丘细胞的哺乳动物卵母细胞；(2)去核：将步骤(1)的卵母细胞经过脱羰秋水仙碱孵育显核、透明带消化，卵母细胞表面形成微小的突起，在体式显微镜下，以步骤(1)得到的卵母细胞表面突起为标识，切除靠近突起的部分卵母细胞质；(3)融合：切除后剩余的卵细胞质作为克隆的受体细胞质，使用上述融合装置将受体细胞质与作为供体细胞融合，形成重构胚；优选的，上述哺乳动物体细胞核移植方法还包括以下步骤：(4)活化重构胚；(5)培养重构胚：重构胚激活后，本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于哺乳动物体细胞核移植的融合装置，包括辅助融合皿和融合槽，所述的辅助融合皿为平面盘状器皿，在所述的辅助融合皿中液体可形成液滴；所述的融合槽中固定有电融合电极，所述的电融合电极与电融合仪相连；所述的辅助融合皿与融合槽的相对位置固定。
【技术特征摘要】
1.一种用于哺乳动物体细胞核移植的融合装置，包括辅助融合皿和融合槽，所述的辅助融合皿为平面盘状器皿，在所述的辅助融合皿中液体可形成液滴；所述的融合槽中固定有电融合电极，所述的电融合电极与电融合仪相连；所述的辅助融合皿与融合槽的相对位置固定。2.如权利要求1所述的融合装置，其特征在于，所述的融合槽固定于辅助融合皿的上方一侧。3.如权利要求1所述的融合装置，其特征在于，所述的上述融合装置中还包括一个固定支持器皿，所述的辅助融合皿和融合槽置于固定支持器皿中并分别固定；和/或，所述的固定支持器皿为平面盘状器皿。4.如权利要求3所述的融合装置，其特征在于，所述的辅助融合皿和固定支持器皿为培养皿，且固定支持器皿的直径大于辅助融合皿的直径和融合槽的长度。5.如权利要求1所述的融合装置，其特征在于，所述的辅助融合皿中包含凹坑，用于放置液滴。6.一种用于哺乳动物体细胞核移植的的融合方法，其具体步骤包括：(1)在权利要求1-5任一项所述的融合装置的辅助融合皿中，将培养液、融合液和PHA分别制成液滴；将融合槽的电极用融合液覆盖；(2)将供体细胞置于辅助融合皿的培养液液滴中；(3)将受体细胞置于辅助融合皿的PHA液滴中，取出后，移至步骤(2)得到的培养液液滴中进行配对；(4)将...
【专利技术属性】
技术研发人员：杜玉涛，G·瓦吉塔，
申请(专利权)人：杜玉涛，G·瓦吉塔，
类型：发明
国别省市：广东;44
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。