本发明专利技术公开了一种高细胞毒活性CIK细胞及在肿瘤细胞免疫治疗中的应用，该CIK细胞通过如下步骤制备：(1)取患者外周血，收集外周血单个核细胞部分；(2)将步骤(1)收集的外周血单个核细胞部分离心，弃去上清液，获得单个核细胞；(3)取单个核细胞按照1×106/mL细胞，加入含500～2000IU/mLγ干扰素和80～120ng/mL化合物(Ⅰ)的完全培养基，开始诱导培养；完全培养基包括含体积百分比为10％FBS的RPMI 1640细胞培养液；(4)步骤(3)的细胞培养20～28小时后，加入50～1000ng/mL抗人CD3单克隆抗体和500～2000IU/mL重组人IL‑2，继续诱导培养，每隔2～3天传代培养一次，诱导培养时间为13～21天，获得CIK细胞。该CIK细胞可用于肿瘤细胞免疫治疗。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于细胞免疫领域，具体涉及一种用于肿瘤细胞免疫治疗的高细胞毒活性CIK细胞以及制备该高细胞毒活性CIK细胞的方法。
技术介绍
免疫治疗作为肿瘤综合治疗的第四种模式，越来越受到重视。肿瘤免疫治疗主要包括肿瘤疫苗治疗、细胞因子治疗、过继性细胞免疫治疗及单克隆抗体免疫治疗等。肿瘤疫苗是利用肿瘤细胞或肿瘤抗原物质诱导机体的特异性细胞免疫和体液免疫反应，增强机体的抗癌能力，阻止肿瘤的生长、扩散和复发。用于抗肿瘤研究的细胞因子主要有干扰素类、白细胞介素类、集落刺激因子类等，其中以IFN-α、IL-2、粒-巨噬细胞集落刺激因子为多。过继性细胞免疫包括淋巴细胞因子活化的杀伤细胞、自然杀伤细胞、肿瘤浸润淋巴细胞、DC-CIK等。单克隆抗体免疫疗法的现有研究结果表明，肿瘤分子靶向治疗具有较好的安全性和有效性，如小分子表皮生长因子受体(EGFR)、酪氨酸激酶抑制剂、抗EGFR单克隆抗体、抗血管内皮生长因子单克隆抗体以及其他分子靶向治疗药物，已在临床中取得较好的疗效。目前用于肿瘤细胞免疫治疗的免疫活性细胞主要有肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)、树突状细胞(DC)以及细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)等。CIK细胞是一种杀伤力强的免疫活性细胞，其主要效应细胞的表面标志为CD3+CD56+，与其他过继性免疫治疗细胞相比，具有增殖速度快、杀瘤活性高、杀瘤谱广等优点。但是，肿瘤病人免疫功能受损，免疫细胞功能减弱，因此，来源于肿瘤病人外周血制备的CIK细胞杀伤肿瘤能力低下，影响CIK细胞疗效。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种用于肿瘤细胞免疫治疗的高细胞毒活性CIK细胞以及制备该高细胞毒活性CIK细胞的方法，该CIK细胞具有很强的增殖力，CD3+、CD8+和CD3+CD56+细胞的比例高，并且对肿瘤治疗效果优异。上述目的是通过如下技术方案实现的：一种用于肿瘤细胞免疫治疗的高细胞毒活性CIK细胞，通过如下步骤制备：(1)取患者外周血，收集外周血的单个核细胞部分；(2)将步骤(1)收集的外周血的单个核细胞部分离心，弃去上清液，获得单个核细胞；(3)取单个核细胞按照1×106/mL细胞，加入含500～2000IU/mLγ干扰素和80～120ng/mL如下结构所示化合物(Ⅰ)的完全培养基，开始诱导培养；其中，完全培养基，包括含体积百分比为10％FBS的RPMI 1640细胞培养液；(4)步骤(3)的细胞培养20～28小时后，加入50～1000ng/mL抗人CD3单克隆抗体和 500～2000IU/mL重组人IL-2，继续诱导培养，其中，每隔2～3天传代培养一次，整个诱导培养的时间为13～21天，获得高细胞毒活性CIK细胞；化合物(Ⅰ)结构为：进一步地，步骤(1)所述收集外周血的单个核细胞部分的方法为：(a)患者外周血中，加入1～1.5倍体积的不含血清的细胞培养液或pH7.2PBS缓冲液稀释，充分混匀；其中，细胞培养液包括：RPMI1640培养液和IMDM培养液；(b)将步骤(a)获得的血液稀释液加入到淋巴细胞分离液的界面上；(c)1500～2500转/分钟，离心15～20分钟，收集中间层，获得单个核细胞。进一步地，步骤(1)中所述收集外周血的单个核细胞部分的方法为：患者经采用血细胞分离机上的淋巴细胞采集程序，单采集患者的外周血单个核细胞。进一步地，步骤(2)中，离心的转速为1000～1500转/分钟，离心的时间为7～10分钟。进一步地，步骤(4)所述继续诱导培养，每2～3天用含500～2000IU/mL重组人IL-2的完全培养基或含500～2000IU/mL重组人IL-2和100～500IU/mL重组人IL-1的完全培养基传代培养。上述化合物(Ⅰ)在制备高细胞毒活性的CIK细胞中的应用。上述用于肿瘤细胞免疫治疗的高细胞毒活性CIK细胞在制备抗肿瘤药物中的应用。有益效果： 本专利技术提供了一种用于肿瘤细胞免疫治疗的高细胞毒活性CIK细胞以及制备该高细胞毒活性CIK细胞的方法，该CIK细胞具有很强的增殖力，CD3+、CD8+和CD3+CD56+细胞的比例高，并且对肿瘤治疗效果优异，可用于肿瘤的细胞免疫治疗。具体实施方式下面结合实施例进一步说明本专利技术的实质性内容。以下实施例中，所用的原料或试剂除特别说明外，均为市售可得。所述患者指需要进行CIK细胞免疫治疗的患者，如癌症患者。另外，以下实施例中，涉及的完全培养基为含10％(体积百分比)FBS的RPMI 1640培养液；冷冻保护剂是含10％(体积百分比)DMSO的培养基，其中，该培养基是由70％(体积百分比)RPMI1640培养液和20％(体积百分比)FBS(胎牛血清)所构成。化合物(Ⅰ)自制。实施例1：CIK细胞的诱导制备和检测一、CIK细胞的诱导制备(1)取患者外周血30mL加入等体积RPMI 1640培养液(Invitrogen公司)，充分混匀。(2)将步骤(1)获得的倍比稀释的外周血60mL，加入到30mL淋巴细胞分离液(上海华精生物高科技有限公司)(比重1.077)的界面上(不要破坏界面)，以2000转/分钟，离心20分钟，取中间层—富含淋巴细胞的白膜层，加入完全培养基20mL。取少量细胞进行细胞计数及苔盼兰活细胞计数染色，结果显示，活细胞达99％。(3)将步骤(2)获得的含有完全培养基的白膜层，以1000转/分钟，离心10分钟，弃上清液，沉淀为单个核细胞。(4)加入完全培养基，细胞计数，用完全培养基调整单个核细胞浓度为1×106/mL。(5)按照1×106/mL细胞，加入γ-IFN(Peprotech公司)和化合物(Ⅰ)使其浓度分别为1000IU/mL和100ng/mL，置37℃、5％CO2培养箱中，开始诱导培养。(6)步骤(5)的细胞培养24小时后，在培养的细胞中，加入500ng/mL抗人CD3单克隆抗体(Biolegend公司)和1000IU/mL重组人IL-2(Peprotech公司)，置37℃、5％CO2培养箱中，继续诱导培养，从而获得CIK细胞。CIK细胞鉴定方法：细胞数量扩增，CD3+CD56+双阳性标志细胞数量升高，杀伤肿瘤细胞能力增强(非MHC限制性)。其中，单个核细胞中加入γ-IFN和化合物(Ⅰ)，经培养24小时后(诱导第1天)，光镜观察发现，细胞活化透亮，折光性强。在单个核细胞中加入抗人CD3单克隆抗体和重组人IL-2，经培养24小时后(诱导第2天)，光镜观察发现，细胞聚集，并且有很多小集落开始形成，细胞明显增大。(7)诱导培养的第四天，细胞传代。按照1份CIK细胞原液，加入3份含1000IU/mL重组人IL-2的完全培养基。同时，取样检测CIK细胞扩增倍数，流式细胞仪检测CD3、CD56、CD4、CD8阳性细胞数，检测CIK细胞杀伤K562肿瘤细胞活性。(8)此后，每3天按照上述方法，传代一次，并做相同的检测。诱导培养的第19天终止培养。以上方法均在严格无菌环境内进行。其中，在诱导第7天时，肉眼下即可观察到白色斑点，光镜下观察发现，细胞集落明显增多、增大，大集落成黑团，看不清细胞形态，周边游离细胞饱满折光性好，大小形态各异。二、按照以上方法进行诱导制备CIK细胞的相应检测结果1、检测CIK细胞扩增倍数 检测方法为：按本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于肿瘤细胞免疫治疗的高细胞毒活性CIK细胞，其特征在于，通过如下步骤制备：(1)取患者外周血，收集外周血的单个核细胞部分；(2)将步骤(1)收集的外周血的单个核细胞部分离心，弃去上清液，获得单个核细胞；(3)取单个核细胞按照1×106/mL细胞，加入含500～2000IU/mLγ干扰素和80～120ng/mL如下结构所示化合物(Ⅰ)的完全培养基，开始诱导培养；其中，完全培养基，包括含体积百分比为10％FBS的RPMI 1640细胞培养液；(4)步骤(3)的细胞培养20～28小时后，加入50～1000ng/mL抗人CD3单克隆抗体和500～2000IU/mL重组人IL‑2，继续诱导培养，其中，每隔2～3天传代培养一次，整个诱导培养的时间为13～21天，获得高细胞毒活性CIK细胞；化合物(Ⅰ)结构为：
【技术特征摘要】
1.一种用于肿瘤细胞免疫治疗的高细胞毒活性CIK细胞，其特征在于，通过如下步骤制备：(1)取患者外周血，收集外周血的单个核细胞部分；(2)将步骤(1)收集的外周血的单个核细胞部分离心，弃去上清液，获得单个核细胞；(3)取单个核细胞按照1×106/mL细胞，加入含500～2000IU/mLγ干扰素和80～120ng/mL如下结构所示化合物(Ⅰ)的完全培养基，开始诱导培养；其中，完全培养基，包括含体积百分比为10％FBS的RPMI 1640细胞培养液；(4)步骤(3)的细胞培养20～28小时后，加入50～1000ng/mL抗人CD3单克隆抗体和500～2000IU/mL重组人IL-2，继续诱导培养，其中，每隔2～3天传代培养一次，整个诱导培养的时间为13～21天，获得高细胞毒活性CIK细胞；化合物(Ⅰ)结构为：2.根据权利要求1所述的高细胞毒活性CIK细胞，其特征在于，步骤(1)所述收集外周血的单个核细胞部分的方法为：(a)患者外周血中，加入1～1.5倍体积的不含血清的细胞培养液或pH7.2PBS缓冲液稀释，充分混匀；其中，细胞培养液包括：RPMI1640培养液和IM...
【专利技术属性】
技术研发人员：丁露露，
申请(专利权)人：丁露露，
类型：发明
国别省市：河南;41
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