鉴定大鸨亲缘关系的成套引物与方法技术

本发明专利技术公开了鉴定大鸨亲缘关系的成套引物与方法。本发明专利技术公开的成套引物，由成套引物甲和能扩增大鸨线粒体DNA片段的引物对组成；大鸨线粒体DNA片段的序列为如下A1)、A2)或A3)：A1)序列表中序列23的核苷酸序列；A2)与A1)限定的DNA序列具有90％以上同一性的由A1)衍生的DNA序列；A3)在严格条件下与A1)限定的DNA序列杂交的由A1)衍生的DNA序列；成套引物甲由序列表中序列3‑序列22所示的20条单链DNA组成。实验证明，本发明专利技术的成套引物与方法可以用来鉴定大鸨间的亲缘关系，为大鸨人工繁育和重引入过程中种源的选定、配对方案的制定、系谱的构建提供技术支撑。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
中鉴定大鸨亲缘关系的成套引物与方法。
技术介绍
大鸨(Otis tarda)隶属鹤形目鸨科，是国际上高度关注的鸟类，而且是中国草原地带的旗舰物种和草原生态系统的指示物种。大鸨有两个地理亚种，即指名亚种(O.t.tarda)和东方亚种(O.t.dybowskii)(Palacín&Alonso,2008)，目前全世界大鸨指名亚种数量约为45000-51000只，而东方亚种却不足1000只，其中逾一半以上片段化分布于中国东北部，并在中国境内完成生活史的各阶段。非法猎捕、栖息地干扰和过度放牧等因素，导致中国大鸨东方亚种的分布区退缩和种群数量锐减。人工繁育是大鸨迁地保护的有效途径之一，但近亲繁殖影响了大鸨的种群健康，甚至会引发近交衰退。繁育过程中如何对大鸨个体择优配对以避免近亲繁殖，以及最大限度保持其遗传多样性，是繁育部门最为关心也亟待解决的问题。通过分子生物学技术，对大鸨个体进行遗传变异检测，并做亲缘关系分析和亲权鉴定能为大鸨的配对筛选和系谱建立提供技术支持，但相关研究尚未见报道。对于具有复杂交配系统的濒危动物，依靠外形特征或行为学观察确定配种个体或鉴定亲子关系，存在较大误差。基于这样的误差登记的系谱记录，将会使误差随着繁殖代数的增加呈几何级数增大。线粒体DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)是细胞核外、线粒体内的遗传物质，具有母系遗传的特征，即子代的线粒体DNA序列与母代的相同，而父代则对线粒体DNA的遗传不作贡献。微卫星DNA为核基因组中的短串联重复序列，为共显性遗传，被广泛应用于评价种群遗传多样性、分析个体间亲缘关系以及鉴定亲子关系。子代的微卫星等位基因一半来自于父代，一半来自于母代。线粒体DNA适用于排除母子关系，经济简便，而微卫星DNA能够确定父源关系，有效可靠。将这2种分子标记结合起来运用于亲子鉴定，有助于制定科学的配种方案、确定不明确的偷配或乱配行为，对于保护濒危动物遗传资源具有极大的理论和实践意义。大鸨性情机警，应激性强。传统采血对其损伤较大甚至致死，且对于野生大鸨，采集血样有困难。粪便和/或羽毛等非损伤性样品在许多濒危动物中已被用于亲缘关系分析，但由于所用的分子标记具有物种特异性，且传统PCR方法费时费力，不及多重PCR方法经济高效，因此，目前急需一种利用非损伤性取样对大鸨进行亲缘关系分析和亲权鉴定的方法。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是如何对大鸨进行亲缘关系分析和亲权鉴定。为解决上述技术问题，本专利技术首先提供了鉴定两个或两个以上大鸨亲缘关系的成套引物。本专利技术所提供的鉴定两个或两个以上大鸨亲缘关系的成套引物，其名称为成套引物甲，是成套引物1和/或成套引物2；所述成套引物1由序列表中序列3-序列12所示的10条单链DNA组成；所述成套引物2由序列表中序列13-序列22所示的10条单链DNA组成。其中，序列3和序列4所示的单链DNA组成一个引物对，序列5和序列6所示的单链DNA组成一个引物对，序列7和序列8所示的单链DNA组成一个引物对，序列9和序列10所示的单链DNA组成一个引物对，序列11和序列12所示的单链DNA组成一个引物对，序列13和序列14所示的单链DNA组成一个引物对，序列15和序列16所示的单链DNA组成一个引物对，序列17和序列18所示的单链DNA组成一个引物对，序列19和序列20所示的单链DNA组成一个引物对，序列21和序列22所示的单链DNA组成一个引物对。上述成套引物甲中，各单链DNA均可独立包装。各单链DNA的摩尔比可依据待测样本确定。各单链DNA的摩尔比可相同。上述成套引物甲中，各单链DNA的5’端均可被HEX、FAM或TET等荧光基团标记。在本专利技术的实施例中，序列3、17和19所示的三条单链DNA的5’端均由HEX标记，序列5、9、11、13、15和21所示的各单链DNA的5’端均由FAM标记，序列7所示的单链DNA的5’端均由TET标记。为解决上述技术问题，本专利技术还提供了鉴定两个或两个以上大鸨亲缘关系的成套引物。本专利技术所提供的鉴定两个或两个以上大鸨亲缘关系的成套引物，其名称为成套引物乙，由能扩增下述a1)、a2)或a3)的引物对与所述成套引物甲组成；a1)大鸨线粒体DNA片段；a2)a1)的任一片段； a3)含有a1)的DNA片段；所述大鸨线粒体DNA片段的序列为如下A1)、A2)或A3)：A1)序列表中序列23的核苷酸序列；A2)与A1)限定的DNA序列具有90％或90％以上同一性的由A1)衍生的DNA序列；A3)在严格条件下与A1)限定的DNA序列杂交的由A1)衍生的DNA序列。这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本专利技术的序列23的核苷酸序列具有90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件(如MEGA 5.0)，两个或多 个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。上述成套引物乙中，A2)所述序列具体可为序列表中序列24-序列28中任一序列。 上述成套引物乙中，所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。上述90％或90％以上同一性，可为90％或95％以上的同一性。上述成套引物乙中，所述引物对由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA组成。在本专利技术的一个实施例中，利用所述引物对对大鸨基因组DNA进行扩增，其PCR产物序列为序列24-序列28，该序列为线粒体DNA控制区dloop片段序列。上述成套引物乙中，各单链DNA均可独立包装。所述成套引物甲与所述引物对的摩尔比可依据待测样本确定。所述成套引物甲与所述引物对中的各单链DNA的摩尔数均可相同。为解决上述技术问题，本专利技术还提供了鉴定两个或两个以上大鸨是否具有母源关系的引物对。本专利技术所提供的鉴定两个或两个以上大鸨是否具有母源关系的引物对，为能扩增上述a1)、a2)或a3)的引物对。所述引物对的两条单链DNA可独立包装。所述引物对的两条单链DNA的摩尔比可为1:1。为解决上述技术问题，本专利技术还提供了鉴定两个或两个以上大鸨亲缘关系的系统。本专利技术所提供的鉴定两个或两个以上大鸨亲缘关系的系统，包括X1；所述X1为所述成套引物甲、所述成套引物乙或所述引物对。所述系统可由所述X1与X2组成；所述X2为进行PCR扩增所需的试剂和/或仪器。进行PCR扩增所需的试剂可为北京博迈德基因技术有限公司的Biomed 2×Taq PCR MasterMix。进行PCR扩增所需的仪器可为PCR仪。所述系统还可由所述X1、所述X2与X3组成；所述X3为进行数据分析所需要的仪器和/或软件和/或模块。进行数据分析所需要的仪器具体可为测序仪(如ABI Prism377测序仪)和/或DNA序列分析仪(如ABI-3730xl型DNA序列分析仪)。进行数据分析所需要的软件具体可为序列比对软件和/或微卫星等位基因分析软件(如Gene本文档来自技高网...

【技术保护点】
鉴定大鸨亲缘关系的成套引物，为成套引物1和/或成套引物2；所述成套引物1由序列表中序列3‑序列12所示的10条单链DNA组成；所述成套引物2由序列表中序列13‑序列22所示的10条单链DNA组成。

【技术特征摘要】
1.鉴定大鸨亲缘关系的成套引物，为成套引物1和/或成套引物2；所述成套引物1由序列表中序列3-序列12所示的10条单链DNA组成；所述成套引物2由序列表中序列13-序列22所示的10条单链DNA组成。2.鉴定大鸨亲缘关系的成套引物，由能扩增下述a1)、a2)或a3)的引物对与权利要求1中所述成套引物1和/或所述成套引物2组成；a1)大鸨线粒体DNA片段；a2)a1)的任一片段；a3)含有a1)的DNA片段；所述大鸨线粒体DNA片段的序列为如下A1)、A2)或A3)：A1)序列表中序列23的核苷酸序列；A2)与A1)限定的DNA序列具有75％或75％以上同一性的由A1)衍生的DNA序列；A3)在严格条件下与A1)限定的DNA序列杂交的由A1)衍生的DNA序列。3.根据权利要求2所述的成套引物，其特征在于：所述引物对由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA组成。4.鉴定大鸨是否具有母源关系的引物对，为权利要求2或3中所述引物对。5.鉴定大鸨亲缘关系的系统，包括X1；所述X1为权利要求1-3中任一所述鉴定大鸨亲缘关系的成套引物或权利要求2或3中所述引物对。6.鉴定大鸨亲缘关系的方法，包括：利用权利要求1所述鉴定大鸨亲缘关系的成套引物分别对待鉴定大鸨的基因组DNA进行PCR扩增，根据PCR扩增产物确定所述待鉴定大鸨间的亲缘关系。7.鉴定大鸨是否具有母源关系的方法，包括：利用权利要求2或3中所述引物对对待鉴定大鸨的基因组DNA进行PCR扩增，根据PCR产物的序列确定所述待鉴定大鸨间的亲缘关系：如所述待鉴定的大鸨间的所述PCR...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘刚，龚明昊，崔丽娟，胡德夫，李林海，韩莫日根，孟德荣，李惠鑫，宁宇，夏晓飞，
申请(专利权)人：中国林业科学研究院林业新技术研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11