本发明专利技术属于害虫抗药性机理与防治领域，具体涉及小菜蛾蛋白酶体亚基α6基因在溴氰菊酯抗性治理中的应用。本发明专利技术用prosalpha6基因RNAi后幼虫的抗药性水平明显下降，用同样剂量的溴氰菊酯处理后，干扰组幼虫的存活率下降了2.5倍，与对照组之间有显著差异。本发明专利技术通过个体和细胞水平分别证明该基因与溴氰菊酯的抗性密切相关，对进一步阐明溴氰菊酯的抗性机理以及在抗性的防治应用中均具有重要的意义。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于害虫抗药性机理与防治领域，具体涉及小菜蛾泛蛋白酶体α6亚基基因prosalpha6及一种治理小菜蛾的溴氰菊酯抗性的方法。
技术介绍
连续、大量、单一使用一种或一类药剂是导致昆虫产生抗药性的主要原因。在连年大量使用某一药剂以后，对该药耐药力弱的昆虫经自然选择后被淘汰，而耐药性强的个体得以存活下来并得到迅速繁殖，从而相关的抗药性基因也通过遗传保留了下来，并且随着化学药剂用量的增加，这些抗药性基因又经过杀虫剂作用和选择，如此逐代的选择作用，抗药性积累加强，昆虫的抗药能力也逐渐增强，这就产生抗药性品系的昆虫。但是有关这些基因与抗药性关系的分析主要是在基因表达水平的差异比较，没有进行相关基因的敲减和增强表达之后对杀虫剂抗性水平影响的细胞和活体研究，缺乏直接的实验证据，因此难以进行开发和应用。小菜蛾prosalpha6基因是20S蛋白酶体的一个结构亚基，尚未有该基因与溴氰菊酯抗性相关的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供小菜蛾对溴氰菊酯的抗性相关基因及其应用。本专利技术首先以果蝇Kc细胞作为模式系统，分析prosalpha6基因与溴氰菊酯抗性的关系。根据GenBank中已有的果蝇prosalpha6基因序列，设计引物克隆出果蝇prosalpha6基因的开放阅读框序列，经过实验证明果蝇prosalpha6基因是溴氰菊酯抗性相关基因。专利技术人进一步实验发现小菜蛾的Prosalpha6蛋白基因在溴氰菊酯抗性品系中的表达水平明显高于敏感品系。本专利技术公开了小菜蛾prosalpha6基因在治理小菜蛾的溴氰菊酯抗性中的应用。小菜蛾蛋白酶体α6亚基基因prosalpha6的dsRNA在制备小菜蛾对溴氰菊酯增敏剂中的应用。一种利用蛋白酶体α6亚基基因prosalpha6治理小菜蛾溴氰菊酯抗性的方法，其步骤是：(1)用prosalpha6的SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2引物，按照MEGAscriptRNAi Kit说明书进行操作，合成小菜蛾蛋白酶体α6亚基基因prosalpha6的dsRNA；(2)核酸酶消化以去除DNA和ssRNA；(3)纯化dsRNA；(4)将prosalpha6的dsRNA喷洒到田间小菜蛾的卵、幼虫和饲料上，通过渗透和取食，dsRNA进入小菜蛾细胞，沉默prosalpha6基因；(5)48小时后施溴氰菊酯类杀虫剂。经研究表明：prosalpha6基因RNAi后幼虫的抗药性水平明显下降，用同样剂量的溴氰菊酯处理后，干扰组幼虫的存活率下降了2.5倍，与对照组之间有显著差异。我们通过个体和细胞水平分别证明该基因与溴氰菊酯的抗性密切相关，因此本专利技术对进一步阐明溴氰菊酯的抗性机理以及在抗性的防治应用中均具有重要的意义。附图说明图1果蝇Kc细胞中prosalpha6的mRNA表达水平(*代表p<0.05)。图2 prosalpha6的RNAi对不同浓度溴氰菊酯胁迫下细胞存活率的影响。*代表p<0.05。图3小菜蛾成活率检测。*代表p<0.05。具体实施方式实施例一1、实验材料小菜蛾源自贵州省贵阳市花溪区中曹乡的甘蓝地，室内繁殖一代后测四龄幼虫的LD50值，与武汉市蔬菜研究所的小菜蛾敏感品系四龄幼虫LD50值比较，发现小菜蛾田间种群为敏感种群。将其作为敏感品系同步隔离培养。小菜蛾溴氰菊酯抗性品系由点滴法处理小菜蛾四龄幼虫敏感品系经多代繁育选育而成。2、prosalpha6的功能研究(1)不同浓度溴氰菊酯对prosalpha6的诱导作用用不同浓度的溴氰菊酯处理果蝇Kc细胞，采用荧光定量PCR技术，检测不同浓度处理细胞中prosalpha6基因的表达水平。结果显示，prosalpha6的表达量随着药物浓度的升高而不断被上调，呈现出一定的线性关系(图1)；(2)prosalpha6基因RNAi对细胞存活率的影响RNA干扰48h后，用不同浓度的溴氰菊酯处理干扰组(dsRNA)和对照组(control)细胞24h，台盼蓝试剂检测细胞存活率，结果表明：在一系列浓度的溴氰菊酯胁迫下，干扰组细胞的存活率明显低于对照组细胞的存活率(图2)。(3)小菜蛾prosalpha6基因RNAi对溴氰菊酯抗性水平的影响①小菜蛾prosalpha6基因RNAi的合成根据prosalpha6基因的保守序列利用pp5软件设计下列引物，合成出小菜蛾prosalpha6基因的dsRNA。上游引物：5′-TAATACGACTCACTATAGGGATGTTTCGCAACCAGTACGA-3′(SEQ ID NO.1)下游引物：5′-TAATACGACTCACTATAGGGCTATGGACGCTGCTCGGT-3′(SEQ ID NO.2)②构建表达载体核酸酶消化以去除DNA和ssRNA。①冰上加样消化液如下②置于37℃孵育1h；纯化dsRNA。①组装反应液②轻轻吹打混匀组装反应液，室温13000rpm条件下离心2min，弃滤液；③吸取500μL Wash Solution加入到制备管中，室温下13000rpm离心2min，弃滤液；④重复步骤③一次；⑤再空管离心30sec以尽可能的去除多余的液体；⑥将制备管放入一个新的收集管中，向其中加入50μL预先加热至大于95℃的Elution Solution，最大转速离心2min，收集滤液；⑦重复步骤⑥一次；⑧分光光度计测定产物的A260以检测dsRNA的浓度将扩增的prosalpha6基因的dsRNA插入pET-2P(购自promega公司)构建双链RNA表达载体pET-2P-pros。③双链RNA在大肠杆菌中的表达取5μL pET-2P-pros质粒加入到50μL解冻后的HT115感受态细胞中，加入IPTG使终浓度为0.1mM，37℃条件下连续培养5h，对照组不加IPTG诱导，相同条件下培养5h。④小菜蛾抗溴氰菊酯品系幼虫喂食dsRNA将菌液和超纯水以1:10的比例混合至菌体沉淀完全溶解，将大小相同的新鲜甘蓝叶片置于菌液中浸泡10s，晾干后放于直径9cm，高1.5cm的玻璃培养皿中，每个培养皿放置15头幼虫。未经IPTG诱导组和只用超纯水处理组作为对照组，同样每个培养皿15头幼虫。各设3个重复，每个重复60头幼虫，连续喂食dsRNA浸渍的新鲜叶片3天。④毒力测定将溴氰菊酯以丙酮作为溶剂配成浓度2500ppm，分别对prosalpha6基因干扰组、未经IPTG诱导组和只用超纯水处理组的小菜蛾幼虫进行毒力测定。适宜条件下培养48小时，统计不同处理组的幼虫死亡数。用镊子触动虫体，不活动者计为死亡，统计死亡率。结果表明，干扰了prosalpha6基因的小菜蛾的成活率均明显低于对照组，并且有统计学差异。水处理对照组设为1(图3)。本文档来自技高网...
【技术保护点】
蛋白酶体α6亚基基因prosalpha6在治理溴氰菊酯抗性中的应用。
【技术特征摘要】
1.蛋白酶体α6亚基基因prosalpha6在治理溴氰菊酯抗性中的应用。2.一种利用蛋白酶体α6亚基基因prosalpha6治理小菜蛾溴氰菊酯抗性的方法，其步骤是：(1)用prosalpha6的SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2引物，按照MEGAscriptRNAi Kit说明书进行操作，合成小菜蛾蛋白酶体α6亚基基因prosalpha6的d...
【专利技术属性】
技术研发人员：程罗根，胡俊丽，程晨，焦东旭，李风良，
申请(专利权)人：南京师范大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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