一种狭鳕鱼皮素及其应用制造技术

本发明专利技术公开一种狭鳕鱼素及其应用，属于生化技术领域，它是以狭鳕鱼皮为原料、由以下步骤制备而成：将鳕鱼皮洗净、切碎，加水进行湿法打浆；加水，混匀后升温至50～60℃，调节pH至7.0，加复合蛋白酶，酶解2～3小时；升温至60～90℃保持10分钟，使酶灭活；采用离心机对鳕鱼皮酶解液离心20～30分钟，收集酶解上清液；将酶解上清液进行冷冻干燥成粉末，得狭鳕鱼素。本发明专利技术的鳕鱼皮素能预防由UVB辐射诱导所致的皮肤鳞状细胞癌，给药方法为皮肤外用，涂抹，不仅对零海拔有效，对高原人群也有效。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生化
，特别涉及一种狭鳕鱼皮素及其应用。
技术介绍
皮肤鳞状细胞癌简称鳞癌，又名表皮癌，是发生于表皮或附属器细胞的一种恶性肿瘤，癌细胞有不同程度的角化。多见于有鳞状上皮覆盖的部位，如皮肤、口腔、唇、食管、子宫颈、阴道等处。此外，有些部位如支气管、膀胱、肾盂等处虽无鳞状上皮覆盖，但可通过鳞状上皮化生而形成鳞状细胞癌。随着工业化的发展，目前环境污染严重，雾霾天气越来越多，人们皮肤非常容易被空气中的有害物质污染，在这种空气中皮肤非常容易发生癌变，目前，市场上有不少品种的药治疗皮肤病，价格昂贵，西药为主，负作用大。
技术实现思路
本专利技术提供了一种狭鳕鱼皮素及其应用，解决现有的预防皮肤鳞状细胞癌药物负作用大的问题。为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案为：本专利技术提供一种狭鳕鱼素，它是以狭鳕鱼皮为原料、由以下步骤制备而成：1)原料预处理：将鳕鱼皮洗净、切碎，加水进行湿法打浆；2)酶解：加入鳕鱼皮重量20～40％的水，混匀后升温至50～60℃，调节pH至7.0，加入鳕鱼皮重量0.1～0.2％的复合蛋白酶，50～60℃的条件下酶解2～3小时；其中，加入的复合蛋白酶是天然的蛋白酶；3)灭活：升温至60～90℃保持10分钟，使酶灭活；4)固液分离：采用离心机对鳕鱼皮酶解液离心20～30分钟，收集酶解上清液；5)干燥：将酶解上清液进行冷冻干燥成粉末，得狭鳕鱼素。其中，优选地，组分中分子量小于3000Da的占组分总数的75％以上。本专利技术并提供了狭鳕鱼皮素在制备预防皮肤鳞状细胞癌药物中应用。其中，优选地，所述药物配制成外用给药制剂。其中，优选地，所述外用给药制剂中狭鳕鱼皮素的含量为5～25％。为了更好的理解本专利技术的实质，下面提供本专利技术狭鳕鱼皮素预防UVB诱导的小鼠皮肤癌药效学试验。实验方法：1紫外线UVB辐射昆明种无毛小鼠致皮肤癌模型的制备(1)制备鼠固定器长宽高分别为：25cmx18cmx3cm(2)随机将昆明种无毛小鼠分为双蒸水涂抹未照射组，模型组，给药组(5％CPWPS组，20％CPWPS组，阳性对照组(5％维生素C组))5组，模型组13只，其他组各组5只，按设计方案给药。背部外涂(1ml/只/天)，用相同规格的毛刷蘸取药物均匀涂布于每只小鼠背部，尽量保证涂布均匀。涂后避光2h后，将动物置于特制的鼠固定器内，暴露其背部相应部位皮肤，置UVB特殊光源下，单次辐射剂量11uw/cm2，单次辐射4h，每天辐照强度为180mJ/cm2，在5周，10周，15周，20周，25周时分别取模型组两只无毛小鼠的皮肤，直至25周后，处死所有的动物，取皮肤组织。2用相机记录各个时期老鼠皮肤的变化情况3HE检测皮肤石蜡包埋：皮肤组织切下后4％多聚甲醛固定24小时，自来水冲洗12h，浸75％乙醇1h，85％乙醇1h，95％乙醇1h，新的95％乙醇再浸1h，100％酒精各浸1h，二甲苯5min，重复一次，浸软蜡1.5h，硬蜡1h。将组织块放入模具中，倒入硬蜡包埋，硬蜡：软蜡＝3:1，将冷却好的腊块取出装在切片固定器上，切片机切成5um的组织块，把切好的切片在40℃温水中展开，贴在载玻片上，晾干，60℃烤片3h后备用。1.HE染色：将烘干的切片浸入二甲苯1中脱蜡10min→将切片从二甲苯1移入二甲苯2中浸泡10min→移入95％的酒精浸泡15min→移入95％的酒精2内浸泡5min→移入80％的酒精内浸泡2min→蒸馏水洗净切片上的酒精→移入苏木精染液中染色5min→自来水洗3min→0.5％盐酸酒精溶液分化数秒，镜检着色程度→自来水充分洗净近20min→蒸馏水洗两次→伊红染液染色2min→系列乙醇脱水，80％乙醇30s→95％乙醇30s→无水乙醇1内浸泡2min→无水乙醇2内浸泡2min→透明，移入二甲苯1内浸泡2min→二甲苯2内浸泡2min→中性树胶封片，显微镜观察。4免疫组织化学1.脱蜡，将切片放入二甲苯1内浸泡5min→二甲苯2内浸泡5min→100％无水乙醇1内浸泡3min→100％无水乙醇2内浸泡3min→95％乙醇1内浸泡3min→95％乙醇2内浸泡3min→85％乙醇内浸泡3min→75％乙醇内浸泡3min→蒸馏水内浸泡3min。2.灭活内源性酶，用蒸馏水新鲜配制3％H2O2，将配好的H2O2滴在玻片的各个组织上，室温放置8min，PBS洗3次，每次3min。3.封闭蛋白间孔隙，滴加5％BSA封闭液，室温放置20min，甩去组织上的液体，不清洗。4.孵育一抗，用PBS稀释一抗，PCNA，EGFR，P-AKT，AQP3，AQP9抗体的稀释倍数分别为:1：200，1：500，1:100，1:300，1:300。每个组织滴加20ul，4℃过夜，PBS洗3次，每次3min。5.滴加二抗，每个组织滴加20ul，37℃1h后，PBS洗3次，每次3min。2.滴加SABC，SABC与二抗结合，每个组织滴加20ul，37℃放置30min,PBS洗4次，每次5min。6.DAB显色，A，B，C液各一滴，加入1ml的蒸馏水内，混匀后加至切片，镜下控制反应时间，5-30min后蒸馏水洗涤。7.苏木素染色，浸入苏木素内30s拿出脱水透明，75％乙醇→85％乙醇→95％乙醇→95％乙醇→100％乙醇→100％乙醇内各浸泡30s→二甲苯内浸泡1min→复染后自来水洗4次。8.封片，中性树胶封片，晾干后显微镜观察。5肿瘤观察随着持续的UVB照射，模型组前五周无毛鼠的皮肤干燥，弹性差，出现红斑，长鳞屑，第十周，脱屑，掉毛，12周开始出现帽针尖大小丘疹，疑似肿瘤丘疹，20周丘疹进一步增多，25周进而变成菜花样瘤体。模型组首次出现肿瘤的时间为UVB照射12周时，而阳性对照组VC组首次出现为第13周，狭鳕鱼皮素两组出现肿瘤的时间均比阳性对照组晚，且25周时平均每只老鼠身上的肿瘤个数较阳性对照组少。表1UVB照射无毛鼠后首次出现肿瘤的时间及肿瘤个数(25周时，n＝5)5.1UVB长期辐射后对无毛鼠皮肤影响的HE染色HE的结果显示昆明种有毛小鼠皮肤组织结构完整，层次清晰，毛囊及汗腺丰富，昆明种无毛小鼠皮肤组织表皮层较有毛小鼠薄，毛囊及汗腺较有毛小鼠少，其他均无不同，(由于正常组5,10,15,20,25周皮肤病理表现差距不大，实验则选择五周的正常皮肤作为对照)UVB照射5周后，模型组无毛小鼠皮肤表皮层较正常组变厚，尤其是棘层；照射10周后，棘层肥厚，表皮突不规则轻度向下延伸；照射15周后，角化过度更加明显，开始出现癌巢，表皮内出现假性角囊肿；照射20周后，角化过度相对15周进一步明显，癌巢增多，黑色素轻微沉积，细胞异型性；照射25周后，黑色素沉积明显，高度的角化过度，弥漫的异型性细胞，癌巢进一步增多且明显，部分伴有鳞癌角珠。而各给药组较模型组均有不同程度的症状减轻。阳性对照组与模型组比较癌巢少，而5％的CPWPS组比模型组表皮增生增厚程度轻，角化程度轻。20％的CPWPS组症状最轻，无弥漫的异型性细胞，无鳞癌角珠。5.2UVB辐射无毛鼠后PCNA表达的变化在本实验中正常组无毛小鼠PCNA的着色强度为浅黄色，用Image-Pro Plus6.0软件分析平均光密度值，25周时模型组无毛小鼠PCNA的表达量明显升高，着色强度为深褐色，与正常组本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种狭鳕鱼素，其特征在于，它是以狭鳕鱼皮为原料、由以下步骤制备而成：1)原料预处理：将鳕鱼皮洗净、切碎，加水进行湿法打浆；2)酶解：加入鳕鱼皮重量20～40％的水，混匀后升温至50～60℃，调节pH至7.0，加入鳕鱼皮重量0.1～0.2％的复合蛋白酶，50～60℃的条件下酶解2～3小时；3)灭活：升温至60～90℃保持10分钟，使酶灭活；4)固液分离：采用离心机对鳕鱼皮酶解液离心20～30分钟，收集酶解上清液；5)干燥：将酶解上清液进行冷冻干燥成粉末，得狭鳕鱼素。

【技术特征摘要】
1.一种狭鳕鱼素，其特征在于，它是以狭鳕鱼皮为原料、由以下步骤制备而成：1)原料预处理：将鳕鱼皮洗净、切碎，加水进行湿法打浆；2)酶解：加入鳕鱼皮重量20～40％的水，混匀后升温至50～60℃，调节pH至7.0，加入鳕鱼皮重量0.1～0.2％的复合蛋白酶，50～60℃的条件下酶解2～3小时；3)灭活：升温至60～90℃保持10分钟，使酶灭活；4)固液分离：采用离心机对鳕鱼皮酶解液离心20～30分钟，收集酶解上清液；5)干燥：将酶解上清液进行...

【专利技术属性】
技术研发人员：韩彦弢，苗德森，赵晨懿，王春波，张德岩，赵雲琪，
申请(专利权)人：青岛海博瑞克生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37