一种来源于凡纳滨对虾抗脂多糖因子基因(nLvALF6)的抗WSSV候选分子标记及其应用。凡纳滨对虾抗脂多糖因子基因(nLvALF6)与抗WSSV显著相关的SNP标记为SEQIDnLvALF6‑g中258bp位置的SNP位点(nLvALF6g‑258‑A>T)。本发明专利技术为对虾抗病分子选育提供了有效的标记，为抗病分子标记在遗传育种中的应用提供了重要指导，在对虾抗WSSV品种选育的研究中具有很好的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及属于水产动物分子遗传学和水产动物种质创新
，涉及一种来源于凡纳滨对虾抗脂多糖因子基因(nLvALF6)的抗WSSV候选分子标记及其应用。
技术介绍
抗脂多糖因子(anti-lipopolysaccharide factor,ALF)是来自甲壳动物的一种小型的抗菌肽，最早从鲎(Limulus polyphemus)血细胞中鉴定出来的，具有明显的抗粗糙型革兰氏阴性菌和抗内毒素效应。功能研究的结果表明甲壳动物ALF具有广谱、强效的抗菌效应(Beale K M,Towle D W,Jayasundara N,Smith CM,Shields JD,Small HJ,Greenwood SJ.Anti-lipopolysaccharide factors in the American lobster Homarus americanus:Molecular characterization and transcriptional response to Vibrio fluvialis challenge.Comparative Biochemistry and Physiology D-Genomics&Proteomics,2008,3(4):263-269)，且其在抗病毒免疫中的功能不断得到证实。中国明对虾的7种ALF均在WSSV潜伏感染期转变为急性感染期后出现显著上调表达(Li S H,Zhang X J,Sun Z et al,2013.Transcriptome Analysis on Chinese Shrimp Fenneropenaeus chinensis during WSSV Acute Infection.Plos One,8(3):e58627)。诸多研究都说明对虾ALF与WSSV侵染过程具有密切关系。凡纳滨对虾是世界三大经济对虾品种之一，也是中国养殖规模最大的品种。近年来，频发的各种对虾疾病尤其是白斑综合症严重阻碍了对虾养殖业发展，每年因病害造成的损失大约有十亿美元(相建海.海水养殖生物病害发生与控制.北京:海洋出版社,2001)，因此培育抗白斑综合症病毒(white spot syndrome virus,WSSV)的凡纳滨对虾新品种已迫在眉睫。由于抗性性状在传统选育过程中较难选择，因此开发抗性相关的分子标记，借助标记进行辅助选择能显著提高选育的效率并降低育种盲目性。目前，对于凡纳滨对虾抗WSSV分子标记的研究还较少，要实现分子辅助抗病品系的培育缺乏可用的标记，因此本研究分析了凡纳滨对虾一种ALF基因(nLvALF6)中的SNP标记，并利用关联分析的方法筛选出该基因中与抗WSSV显著相关的分子标记，为分子标记辅助抗病群体选育提供有效的标记和技术手段。
技术实现思路
：本专利技术的目的是提供一种来源于凡纳滨对虾抗脂多糖因子基因 (nLvALF6)的抗WSSV候选分子标记及其应用。一种来源于凡纳滨对虾抗脂多糖因子基因(nLvALF6)的抗WSSV候选分子标记，凡纳滨对虾抗脂多糖因子基因(nLvALF6)与抗WSSV显著相关的SNP标记为SEQIDnLvALF6g中258bp位置的SNP位点(nLvALF6g-258-A>T)。所述SNP位标记点nLvALF6g-258-A>T抗性优势基因型为A/T杂合。一种用于检测来源于凡纳滨对虾抗脂多糖因子基因(nLvALF6)的抗WSSV候选分子标记的引物对，nLvA6F：ACTTCCTTTAGCCTTAACTTCCCGTnLvA6R：TCAGATGTAACAGTATGAACCCA。一种来源于凡纳滨对虾抗脂多糖因子基因(nLvALF6)的抗WSSV候选分子标记的应用，所述凡纳滨对虾抗性相关的多组合分子标记在遗传多样性分析筛选、分子标记辅助育种中的应用。本专利技术的优点：本专利技术以凡纳滨对虾的ALF基因(nLvALF6)中筛选出与抗WSSV性状显著相关的SNP标记，并应用该标记指导抗WSSV对虾良种的选育,具体包括：1.本专利技术筛选获得的抗WSSV相关分子标记能够在分子水平上实现抗病个体的筛选，在个体较小的时候即可进行选择，从而提高选育的效率。2.通过标记辅助选择，可以避免环境因素导致选育的选育误差，提高选育准确率。具体实施方式下面结合实例对本专利技术作进一步说明，但本专利技术并不限于以下的实施例内容。本专利技术首先筛选nLvALF6基因中的SNP位点，通过分析这些位点在凡纳滨对虾WSSV抗性群体和敏感群体中分布的差异，筛选获得nLvALF6基因中抗WSSV相关SNP位点，并使用该位点在育种材料中进行分型，辅助抗性选育。上述WSSV抗性群体和敏感群体的获得方式是通过投喂WSSV感染致死的病虾进行攻毒，确保攻毒成功后，收集最先死亡的虾组成敏感群体，收集最后死亡的虾组成抗性群体。上述nLvALF6基因中SNP位点的获得是通过如下方式：1、通过转录组和基因组信息获得nLvALF6基因组全长序列；2、在抗性和敏感群体材料中随机各选择8个个体进行DNA提取并对该序列进行分别测序；3、根据测序结果筛选出nLvALF6基因的SNP位点。上述所述的筛选nLvALF6基因中与抗WSSV性状相关的SNP方式如下：对筛选到ALF基因中的SNP位点在抗性材料和敏感材料中进行基因分型，统计两组材料中每个SNP位点的基因频率和基因型频率，通过卡方检验，筛选出两组材料中呈现显著差异的位点nLvALF6g-258-A>T(P<0.05)，这个差异位点可以通过如下引物对扩增PCR产物后通过一代测序实现基因分型：nLvA6F：ACTTCCTTTAGCCTTAACTTCCCGTnLvA6R：TCAGATGTAACAGTATGAACCCA。上述所述的分子标记的抗性相关基因型为：A/T杂合基因型。实施例1：对虾抗WSSV相关的SNP标记的获得1.WSSV易感和抗性材料的获得WSSV易感和抗性材料来源于“科海一号”多家系的混合群体。选取500尾健康凡纳滨对虾置于12个50L的水族箱中，实验前随机取10尾对虾检测无WSSV感染，实验水温为(23±1)℃。经饥饿处理后，投喂WSSV感染致死的病虾(WSSV病毒含量为104-106copy/ng DNA)。攻毒后每天检查3次(每次间隔6h)并收集死虾，随机取样提取基因组DNA，最早死亡的48尾对虾作为WSSV易感组(susceptive group,sus)。至攻毒后第14天，凡纳滨对虾存活情况稳定，取存活的48尾对虾作为WSSV抗性组(resistant group,res)。2.基因组DNA提取凡纳滨对虾DNA的提取按照TIANGEN植物基因组DNA提取试剂盒说明进行。分别提取上述抗性组和易感组的个体DNA，将提取获得的DNA使用NanoDrop 1000检测DNA浓度和纯度，将经检测DNA浓度>50ng/μl和纯度OD260/280为1.7-1.9的个体DNA再经1％的琼脂糖凝胶电泳检测，电泳检测DNA片段完整性的个体，即为合格的DNA样品，在-20℃保存待用。。3.nLvALF6基因组序列的获得利用转录组注释信息获得nLvALF6的cDNA序列，之后将该cDNA序列与本课题组获得的凡纳滨本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种来源于凡纳滨对虾抗脂多糖因子基因(nLvALF6)的抗WSSV候选分子标记，其特征在于：凡纳滨对虾抗脂多糖因子基因(nLvALF6)与抗WSSV显著相关的SNP标记为SEQIDnLvALF6‑g中258bp位置的SNP位点(nLvALF6g‑258‑A>T)。
【技术特征摘要】
1.一种来源于凡纳滨对虾抗脂多糖因子基因(nLvALF6)的抗WSSV候选分子标记，其特征在于：凡纳滨对虾抗脂多糖因子基因(nLvALF6)与抗WSSV显著相关的SNP标记为SEQIDnLvALF6-g中258bp位置的SNP位点(nLvALF6g-258-A>T)。2.按权利要求1所述的来源于凡纳滨对虾抗脂多糖因子基因(nLvALF6)的抗WSSV候选分子标记，其特征在于：所述SNP位标记点nLvALF6g-258-A>T抗性优势基因型为A/T...
【专利技术属性】
技术研发人员：于洋，李富花，刘敬文，相建海，张晓军，
申请(专利权)人：中国科学院海洋研究所，
类型：发明
国别省市：山东;37
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