里氏木霉QM6A及其衍生株中与交配损伤相关的基因/遗传元件及其鉴定方法技术

本发明专利技术涉及鉴定里氏木霉QM6a菌株或其衍生菌株中与交配损伤相关的基因/遗传元件的方法，所述方法包括：a)提供第一菌株，所述菌株是具有MAT1‑2基因座的里氏木霉QM6a菌株或其衍生菌株；b)使所述菌株与第二菌株进行有性杂交，所述第二菌株是具有补充的基因座(即MAT1‑1基因座)的里氏木霉(红褐肉座菌)菌株的能交配菌株；c)使来自b)中的杂交或其回交中的MAT1‑1子代与a)中的第一菌株进行反复回交，直到获得与所述第一里氏木霉QM6a菌株或其衍生菌株基本上相同，但是携带MAT1‑1基因座并且能够交配以与里氏木霉QM6a或其任何MAT1‑2子代杂交的菌株；d)从步骤c)选择能够交配以与具有MAT1‑2基因座的里氏木霉(红褐肉座菌)杂交的子代；以及e)通过将步骤d)中所选的子代的基因组和a)中第一菌株的基因组序列进行比较，来鉴定与交配损伤相关的基因/遗传元件，其中在第一菌株中所述基因/遗传元件完全或部分缺失，或者以突变形式或具有缺失和/或插入的形式存在，因此是里氏木霉QM6a菌株或其衍生菌株中与交配损伤直接或间接相关的基因或遗传元件；本发明专利技术还涉及修正里氏木霉QM6a菌株或其衍生菌株的交配损伤的方法，所述菌株具有MAT1‑1基因座并且不能与具有MAT1‑2基因座的里氏木霉QM6a菌株或其衍生菌株交配，其中如上鉴定的一个或多个突变的或者完全或部分缺失的基因和/或遗传元件是被相应的功能性基因和/或遗传元件替代或补充。此外，本发明专利技术涉及由此获得的木霉属真菌菌株在工业育种和目的产物的生产中的用途。此外，本发明专利技术涉及与里氏木霉QM6a和其衍生菌株的交配损伤相关的基因，并且涉及里氏木霉QM6a和其衍生菌株的交配所必需的基因。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及与里氏木霉(Trichoderma reesei)QM6A菌株或衍生菌株的交配损伤(mating impairment)相关的基因/遗传元件。本专利技术还涉及用于鉴定与里氏木霉QM6A及其衍生菌株的交配损伤相关的基因/遗传元件的方法。所述方法使得能够快速并有效鉴定与交配损伤相关的基因/遗传元件。因此，本专利技术涉及促使操作里氏木霉的工具朝向改良和便利的菌株育种的方向发展，从而能够通过经典遗传方法改良工业生产菌株的方法。这不仅在菌株育种和维持方面增加了其他工具，还允许引入来自里氏木霉的其他菌株(红褐肉座菌(Hypocrea jecorina))的遗传性状，或者允许去除菌株的不想要的基因突变和/或不想要的基因(例如赋予抗生素抗性的基因，标记基因，以及次级代谢、色素形成、不想要的酶的基因等)。
技术介绍
丝状真菌能够生成大量胞外蛋白质。但是，在天然存在的菌株中任何目的蛋白质的生产水平通常太低而无法用于商业开发，这使实质性的菌株改良方案至关重要(Punt 2002)。在工业丝状真菌中，这常规上是通过经典诱变和/或靶基因操作结合蛋白质工程来实现。所述方法基本上由以下步骤组成：使真菌接受亚致死剂量的诱变剂(通常使用例如，通过紫外线或电离辐射照射，添加化学诱变剂例如亚硝基甲基胍、甲基磺酸乙酯或溴化乙锭)，以及随后筛选存活菌株中所需产物的改良的生产。这种方法显然仅与选择方法一样好。里氏木霉(有性型红褐肉座菌)是酶的工业生产的主要生物。通过使用随机诱变，学术和工业研究项目在几十年中已经制备了酶产率比“原始”里氏木霉菌株QM6a高出数倍的里氏木霉菌株，所述“原始”里氏木霉菌株QM6a于1944年从所罗门群岛的美军帐篷帆布中分离(LeCrom et al.2009)。但是，使用随机突变进行菌种改良的主要限制源于以下事实：通过定义可知，其不能被引导作用于独特的靶基因。因此，突变可能不仅是有利的并且改良或破坏靶基因，还可能影响其他基因，导致不想要的附加损伤，导致例如菌株稳定性的限制、生长速率降低或氨基酸和/或维生素营养缺陷型。尽管重组技术通过引入靶向焦点而克服了所述问题，但是它们可能不适用于由未知基因或多个基因或大基因组片段引起的复杂遗传性状。Seidl等人(2009)首先记载了里氏木霉进行有性繁殖的能力。在分类学上，里氏木霉(以及其有性型红褐肉座菌)属于子囊菌纲(Ascomycetes)(粪壳菌纲(Sordariomycetes))，并且在该组中属于作为异宗配合的那些真菌。异宗配合的意思是，成功进行有性繁殖所必需的两种交配型基因座MAT1-1和MAT1-2存在于不同菌株，并且不可能进行自体受精。在有性繁殖过程中，里氏木霉生成子囊壳，其由包含产囊体的卷曲结构或各种独特结构开始。所述产囊体是在交配中接受细胞核并继续生成双核菌丝系统的细胞。在所述卷曲(coil)内细胞中的一个作为产囊体发挥作用，其余细胞保持不活跃状态或产生会分枝并增殖以包围整个结构的菌丝。在许多情况下，周围的菌丝也会包封所述卷曲。所述周围的菌丝最终联合形成子囊壳的外壁或包被(peridium)(http://website.nbm-mnb.ca/mycologywebpages/NaturalHistoryOfF ungi/SordariomycetesDiscussion.html)(图3)。里氏木霉子囊壳的形成出现囊子实层(ascohymenial)，意味着子囊果形成是从产囊体的受精开始。原基随后直接从有生殖力的产囊菌丝分化成真正的子实层。因此，所述囊子实层发育是从生殖菌丝的受精和分化开始，然后是子囊果发育。因此，在有性繁殖中，子座(子实体)是由作为雌性发挥功能的伴侣形成。由于现在用于工业中的里氏木霉的所有菌株都可以追溯到菌株QM6a，它们同菌株QM6a一样全部携带MAT1-2基因座。因此，目前不可能使不同工业菌株相互杂交以通过引入有利的性状或去除菌株的基因突变或不想要的基因(例如，赋予抗生素抗性的基因，编码其存在会干扰调控需求的不想要的产物的基因)来进一步改良菌株。克服不能使不同里氏木霉突变菌株杂交的问题的可能性是，将配型基因座与同一基因组基因座上的相反交配型基因座交换。对里氏木霉QM6a而言，这表示将MAT1-2基因座与MAT1-1基因座交换。Kang等(1994)已经证明，其中MAT基因座发生交换的稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)菌株在与相反交配型菌株的杂交中是能育的(即，其中的MAT1-2基因座被MAT1-1基因座替代的菌株在与原始MAT1-2携带菌株的交配中是能育的)。还记载了粗糙链孢霉(Neurospora crassa)的交配型基因座的成功交换(Chang,1994)。WO 2011/095374涉及使用交配型转换以改良丝状真菌菌株的性行为。公开了鉴定黑曲霉(Aspergillus niger)和塔宾曲霉(Aspergillus tubigensis)的交配型以将黑曲霉转化为异宗配合真菌，即具有相反交配型的丝状真菌个体,产生一对或多对具有两种相反交配型的菌株。Seidl等(2009)将补充的交配型基因座异位引入里氏木霉菌株QM6a，从而生成携带两个交配基因座(MAT1-1和MAT1-2)的菌株。所述菌株在与携带MAT1-1或MAT1-2基因座的里氏木霉有性型红褐肉座菌的野生型菌株的杂交中是能育的。但是，该菌株在与菌株QM6a及其衍生菌株(全部是MAT1-2)的杂交中是不育的。根据这些结果——携带两种交配型的QM6a菌株能够与红褐肉座菌的MAT1-1和MAT1-2菌株形成子实体，但是不与QM6a形成子实体——可得出结论:里氏木霉QM6a能够作为雄性伴侣发挥作用但是无法生成子实体，并且因此是雌性不育的。在没有用于保持交配能力的选择压力的情况下，其在实验室中维持60年以上，这可能导致对于有性重组来说所必需的基因中的一个或多个中的突变。因此，在现有技术中需要允许快速并有效鉴定与里氏木霉QM6a菌株的所述交配损伤相关的基因的方法。迄今为止，尚既未鉴定也未表征里氏木霉QM6a基因组中与交配损伤相关的基因。其原因主要是由于以下事实：由于里氏木霉QM6a的自体不育性，尚未建立用于里氏木霉QM6a的使用有性杂交的经典遗传方法。此外，尚不知晓哪个基因促成或导致QM6a的自体不育性。迄今为止，完全不知晓QM6a基因组(34.1Mbp)9143个注释基因(annotated gene)中哪个与其自体不育性相关。在Martinez et al.(2008)中公开了里氏木霉QM6a的基因组。所述里氏木霉的核苷酸序列和注释数据已经以登录号AAIL 00000000保存于GenBank。本专利技术人最近将QM6a的MAT1-2基因座用同一基因组位置上的相反交配型基因座(MAT1-1)局部替代，但是所得到的MAT1-1菌株与里氏木霉QM6a衍生的MAT1-2菌株的杂交不成功，说明了自体不育性。因此，本专利技术的目的是鉴定并提供与里氏木霉QM6a菌株及其衍生菌中的交配损伤相关的基因/遗传元件。本专利技术的另一个目的是提供快速并有效鉴定与里氏木霉QM6a中的交配损伤相关的基因的方法。本专利技术的另一个目的是提供恢复里氏木霉QM6a及其衍本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于鉴定里氏木霉(Trichoderma reesei)QM6a菌株或其衍生菌株中与交配损伤相关的基因/遗传元件的方法，所述方法包括以下步骤：a)提供第一菌株，所述菌株是具有MAT1‑2基因座的里氏木霉QM6a菌株或其衍生菌株；b)使所述菌株与第二菌株进行有性杂交，所述第二菌株是具有补充的MAT1‑1基因座的里氏木霉(红褐肉座菌(Hypocrea jecorina))的能交配的菌株；c)使来自b)中的杂交或其回交的MAT1‑1子代与a)的第一菌株进行反复回交，直到获得与所述第一里氏木霉QM6a菌株或其衍生菌株基本上相同，但是携带MAT1‑1基因座并且能够交配以与里氏木霉QM6a或任何其MAT1‑2子代杂交的菌株；d)从步骤c)选择能够交配以与具有MAT1‑2基因座的里氏木霉(红褐肉座菌)杂交的子代；以及e)通过将步骤d)中所选的子代的基因组和a)中第一菌株的基因组序列进行比较，来鉴定与交配损伤相关的基因/遗传元件，其中在第一菌株中所述基因/遗传元件可完全或部分缺失，或者以突变形式或具有缺失和/或插入的形式存在，因此是与里氏木霉QM6a菌株或其衍生菌株中的交配损伤直接或间接相关的基因或遗传元件。...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2012.12.28 EP 12199606.0;2012.12.28 US 61/746,8611.一种用于鉴定里氏木霉(Trichoderma reesei)QM6a菌株或其衍生菌株中与交配损伤相关的基因/遗传元件的方法，所述方法包括以下步骤：a)提供第一菌株，所述菌株是具有MAT1-2基因座的里氏木霉QM6a菌株或其衍生菌株；b)使所述菌株与第二菌株进行有性杂交，所述第二菌株是具有补充的MAT1-1基因座的里氏木霉(红褐肉座菌(Hypocrea jecorina))的能交配的菌株；c)使来自b)中的杂交或其回交的MAT1-1子代与a)的第一菌株进行反复回交，直到获得与所述第一里氏木霉QM6a菌株或其衍生菌株基本上相同，但是携带MAT1-1基因座并且能够交配以与里氏木霉QM6a或任何其MAT1-2子代杂交的菌株；d)从步骤c)选择能够交配以与具有MAT1-2基因座的里氏木霉(红褐肉座菌)杂交的子代；以及e)通过将步骤d)中所选的子代的基因组和a)中第一菌株的基因组序列进行比较，来鉴定与交配损伤相关的基因/遗传元件，其中在第一菌株中所述基因/遗传元件可完全或部分缺失，或者以突变形式或具有缺失和/或插入的形式存在，因此是与里氏木霉QM6a菌株或其衍生菌株中的交配损伤直接或间接相关的基因或遗传元件。2.根据权利要求1的方法，所述方法还包括将能交配菌株的功能性基因和/或遗传元件——其对应于权利要求1鉴定的与交配损伤相关的基因/遗传元件——插入到具有MAT1-1基因座的里氏木霉QM6a或其衍生菌株中，并使所述菌株与具有MAT1-2基因座的里氏木霉QM6a或其衍生菌株杂交，籍此由具有MAT1-1基因座并具有插入的所述功能性基因和/或遗传元件的里氏木霉QM6a或其衍生菌株形成子实体，表明所述基因/遗传元件与所述交配损伤直接相关。3.一种用于鉴定与功能性基因和/或遗传元件——其对应于权利要求1的方法鉴定的与里氏木霉QM6a或其衍生菌株的交配损伤相关的基因/遗传元件——相关的能交配表型的方法，所述方法包括以下步骤：a)提供能交配的里氏木霉QM6a MAT1-1菌株；b)使上述功能性基因或遗传元件不具备功能；以及c)测量所述里氏木霉QM6a MAT1-1菌株的交配能力，其中所述里氏木霉QM6a MAT1-1菌株的阳性交配能力表明所述基因或遗传元件对能交配表型而言是非必需的，并且其中所述里氏木霉QM6a MAT1-1菌株的阴性交配能力表明所述基因或遗传元件对能交配表型而言是必需的。4.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述衍生自里氏木霉QM6a的菌株选自QM9123、QM9136、QM9414、MG4、MG5、RUT-C30、RUT-D4、RUT-M7、RUT-NG14、MCG77、MCG80、M5、M6、MHC15、MHC22、Kyowa X-31、Kyowa PC-1-4、Kyowa PC-3-7、TU-6以及其衍生菌株。5.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述第二菌株是CBS999.97 MAT1-1。6.权利要求1-5中任一项的方法，其中所述回交重复7-19个循环。7.权利要求6的方法，其中所述回交重复8-9个循环。8.权利要求1-7中任一项的方法，其中所述与交配损伤直接或间接相关的基因/遗传元件选自SEQ ID NO:8-155和SEQ ID NO:163-170。9.权利要求8的方法，其中所述与交配损伤直接或间接相关的基因/遗传元件是选自以下的基因/遗传元件：SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:66、SEQ ID N...

【专利技术属性】
技术研发人员：C·P·库比切克，R·林克，B·赛博斯，T·哈曼，P·劳伦茨，
申请(专利权)人：AB酶有限公司，
类型：发明
国别省市：德国;DE