本发明专利技术公开了一种用于检测微量组织中KRAS基因突变的引物组合，其包括预扩增引物组、用于检测2号外显子突变的引物组、用于检测3号外显子突变的引物组；该方法旨在将微量的DNA通过预扩增得到较高浓度的DNA模板，结合直接测序法检测样本中KRAS基因的突变情况；将该引物组合应用于制备检测KRAS基因突变的检测试剂中，可检测样本的DNA浓度低至100pg，且可以同时检测KRAS基因第2和3号外显子的所有突变，本发明专利技术提供的检测方法灵敏度高，特异性强，成本低，适用于临床肿瘤患者KRAS基因突变的检测，具有很好的临床应用价值。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物检测
，具体涉及一种用于微量组织中KRAS基因突变检测的引物组合及其在肿瘤用药选择和疾病诊断相关方面的应用。
技术介绍
Ras为一种原癌基肿瘤的发生发展，最初是从大鼠肉瘤病毒中克隆而得。哺乳动物基因组中普遍存在三种RAS癌基因家族成员：H-RAS、K-RAS、N-RAS，这三种基因编码的蛋白质大约有90%的氨基酸同源序列，分子量均为21kDa，故称为RASp21蛋白。KRAS基因是RAS基因家族中三种癌基因的一种，位于12号染色体上，含有4个编码外显子和1个5’端非编码外显子，共同编码含189个氨基酸的RAS蛋白。KRAS是表皮生长因子受体功能信号的下游分子，属膜结合型GTP／GDP结合蛋白，通过GTP和GDP的相互转化作用有节制的调节KRAS基因对信号系统的开启和关闭，传递细胞生长分化信号（Tsuchida N, et al , 2016）。KRAS基因突变发生在肿瘤恶变的早中期，并且原发灶和转移灶的KRAS基因状态基本保持一致。目前研究发现，KRAS基因在膀胱、乳腺、直肠、肾、肝、肺、卵巢、胰腺、胃，还有造血系统等均在一定频率的突变，其中以结直肠癌、胰腺癌和肺癌的发生率比较高，在胰腺癌组织高达90％以上，在肺癌中则以肺腺癌为主，突变率为20～30％，结直肠癌患者突变率为27～43％（Zeitouni D,et al, 2016; Kempf E, et al, 2016）。KRAS基因最常见的突变方式为点突变，90％的KRAS基因突变位于2号外显子的第12和13密码子位点，另有1～4％为第3号外显子的第61密码子突变（Bournet B,et al, 2016）。当KRAS基因发生突变时，该基因永久活化，不能产生正常的RAS蛋白，导致RAS蛋白不依赖EGFR受体激活而持续活化，造成RAS信号通路的异常活化，影响细胞的生长、增殖和分化，促进细胞的恶性转化，导致细胞增殖失控而癌变（Ricciuti B, et al, 2016）。美国国家癌症综合网络（NCCN）指出KRAS基因突变会使肺癌患者对EGFR酪氨酸激酶抑制剂产生耐药；使结肠癌患者对抗EGFR抗体类药物产生耐药。所以NCCN提出肿瘤患者接受EGFR靶向药物治疗之前，必须进行KRAS基因突变检测，根据检测结果决定是否使用EGFR靶向药物作为临床治疗措施。因此KRAS基因突变检测能够提高肿瘤临床治疗的针对性，降低治疗费用，节约宝贵的治疗时间。目前针对KRAS突变的检测方法有很多，如直接测序法，该法对样本要求较高，检测范围有限。多态性分析法（RFLP），是将PCR与限制性酶切相结合的一种方法，此实验操作繁琐，检测周期长，成本高昂，存在第一轮酶切不完全导致的假阳性。Taqman水解探针法，使用扩增阻滞突变系统（ARMS）与荧光探针结合来检测突变，针对该方法设计的引物，使得突变型得到扩增，野生型无法扩增，从而增强了突变信号，便于检测。但是ARMS技术应用最后一个碱基不匹配并不能完全阻滞野生型DNA的扩增，存在假阳性的风险，且只能针对特异性位点检测。此外，如高效液相色谱、毛细血管电泳等，需要特殊的仪器设备，且操作复杂，不利于在临床上进行大范围的推广。核酸序列扩增法（NASBA）、自序序列复制法（3SR）和链置换复制法（SDA）虽均为等温扩增法，但是它们对目的序列的扩增特异性不强。尽管如此，KRAS突变的检测方法仍以肿瘤组织标本检测为金标准，但是临床上常常由于组织样本获取不足量，使其检测具有一定的局限性。因此临床上亟需一种高效准确全面地检测微量组织中KRAS基因突变的产品及方法，以便于为肿瘤个性化治疗服务。为此，本专利技术利用恒温扩增与直接测序相结合的方法，建立了一套针对微量组织样本中KRAS基因所有突变类型检测的技术流程，该检测方法灵敏度高，特异性强，成本低，有利于临床使用和推广。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种具有高特异性和灵敏度的检测微量组织样本中KRAS基因突变的引物组合，以组织DNA为检测对象，结合恒温预扩增技术和普通PCR技术，通过直接测序法确定肿瘤样本中有无KRAS基因突变，可对KRAS基因的突变进行准确的检测。本专利技术提供的引物组合能检测出KRAS基因发生在第2和3号外显子的所有突变。本专利技术提供的用于检测KRAS基因突变的引物组合包括如SEQ ID NO：1- SEQ ID NO：18所示的预扩增引物组、如SEQ ID NO：19- SEQ ID NO：20所示的用于检测2号外显子突变的引物组、如SEQ ID NO：21- SEQ ID NO：22所示的用于检测3号外显子突变的引物组。本专利技术的另一目的是将上述引物组合应用在制备检测KRAS基因突变的检测试剂中。本专利技术的另一目的是将上述引物组合应用于制备用于检测KRAS基因突变的检测试剂盒中，所述试剂盒组分还包含下列常规组分中的一种或几种：聚合酶、引物组合、PCR反应缓冲液、dNTP、BSA、去离子水。本专利技术用于检测KRAS基因突变的引物组合的检测使用方法，具体步骤如下：（1）引物稀释将primer1-prime18分别稀释后混匀制得Primer Mix（表1），其中primer1-primer16引物的终浓度为0.05-0.1μM，primer17-primer18引物的终浓度为1-3μM；primer19-primer22引物（表1）稀释至5-10μM。（2）预扩增在扩增管中加入1μL的10×反应缓冲液、2.5μL的Primer Mix、100-1000pg微量DNA模板（本专利技术采用的DNA模板来源于结肠癌病人组织，并按照《分子克隆实验指南》中所述常规方法提取组织DNA）、用去离子水补足至8.8μL；混匀，98℃预变性5-10min，然后置于冰上10-20min；再加入0.5μL dNTP (10mM each)、0.2μL 100×BSA以及0.5μL phi29 DNA聚合酶，30-35℃扩增过夜，65℃加热10-20min使酶失活。（3）使用PCR纯化试剂盒纯化上述预扩增产物。（4）KRAS基因突变检测针对KRAS基因的2,3号外显子突变，分别采用如SEQ ID NO:19- SEQ ID NO:20所示的引物组检测2号外显子突变；如SEQ ID NO:21- SEQ ID NO:22所示的引物组检测3号外显子突变。配置PCR反应总体系为25μL：其中Pfu Mix混合液12.5μL、所述正向引物(5-10μM)的体积0.5-1μL、反向引物(5-10μM)的体积0.5-1μL、预扩增产物1-2μL、用水补足至25μL。PCR反应条件为：①94℃，5min预变性；②94℃，30s变性；③55℃，30s退火；④72℃，35s延伸；循环②至④35次；⑤72℃，5min；测序检测。本专利技术的检测优势在于： 本专利技术采用多引物组合、利用恒温扩增及普通PCR相结合的方法，解决了组织样本中初始DNA含量低的，无法进行KRAS基因突变检测的局限性。本专利技术中使用的试剂价格低廉，可大批量的处理样本。本专利技术方法扩增效率高，如100pg的DNA经扩增后可得到1000ng/μL；可同时检测多位点的突变情况。本专利技术方法DNA扩增后DNA忠实性好。总之，使用本专利技术方法可实现对微量本文档来自技高网...
【技术保护点】
用于检测微量组织中KRAS基因突变的引物组合，其特征在于:包括如SEQ ID NO:1‑ SEQ ID NO:18所示的预扩增引物组、如SEQ ID NO:19‑ SEQ ID NO:20所示的用于检测2号外显子突变的引物组、如SEQ ID NO:21‑ SEQ ID NO:22所示的用于检测3号外显子突变的引物组。
【技术特征摘要】
1.用于检测微量组织中KRAS基因突变的引物组合，其特征在于:包括如SEQ ID NO:1- SEQ ID NO:18所示的预扩增引物组、如SEQ ID NO:19- SEQ ID NO:20所示的用于检测2号外显子突变的引物组、如SE...
【专利技术属性】
技术研发人员：盛苗苗，李珊珊，罗瑛，唐文如，王芳，赵月光，张继虹，贾舒婷，吴晓明，刘静，周若宇，旦菊花，
申请(专利权)人：昆明理工大学，
类型：发明
国别省市：云南;53
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