本发明专利技术公开了一种检测ST251型嗜水气单胞菌的PCR试剂盒及应用，该试剂盒：a)PCR Premix；b)引物对；c)标准阳性DNA模板；d）标准阴性DNA模板；e)灭菌双蒸水，上游引物序列5’‑GCGGCGTAAGCGGATTTGTAGC‑3’，下游引物序列5’‑CCGGTCGGATTGGTCAGGTTCAT‑3’，退火温度为63℃，正确的扩增产物大小为826bp，标准阳性DNA模板为ST251型嗜水气单胞菌XS91‑4‑1株的基因组DNA提取物，DNA浓度为500ng/μl；阴性DNA模板为维氏气单胞菌IB340株的基因组提取物，DNA浓度500ng/μl，该试剂盒适用于所有类型的基因扩增仪，检测特异性强，灵敏度高、快速而准确、稳定性好。可用于淡水鱼类暴发病和其它鱼类由嗜水气单胞菌引起的败血症的快速诊断、细菌快速检测和鉴定，并继而在疾病的预测、预报以及流行病学研究中得到广泛应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，更具体涉及一种快速检测ST251型致病性嗜水气单胞菌的试剂盒，还涉及一种检测ST251型致病性嗜水气单胞菌的试剂盒用途，可用于淡水养殖鱼类暴发病和其它淡水鱼类由嗜水气单胞菌引起的败血症的快速鉴别诊断和流行病学研究，还可以为相关基础研究提供技术支持。
技术介绍
气单胞菌(aeromonads)是我国淡水养殖鱼类中最常见的病原性细菌，几乎可以侵害各种水产养殖动物。它们存在于水产养殖系统中的各个生态位，是健康水生动物肠道的主要常居菌之一。分类上属于γ-变形菌纲、气单胞菌科、气单胞菌属，已被认可的种类至少在25种以上，而且新种在不断被报道。嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila,Ah)是该属的代表种，也是最常被鉴定为鱼类病原菌的气单胞菌。一般认为，多数嗜水气单胞菌是条件致病菌。嗜水气单胞菌引起水产动物疾病有急性的，也有慢性的，症状会有不同表现，如体表溃烂、肠炎、烂尾、烂鳍、红皮炎、竖鳞，腹水病以及败血症等，所以嗜水气单胞菌的不同菌株之间其毒力(致病性)是不一样的。然而，从上世纪80年代末开始至今，发生在我国由嗜水气单胞菌引起的鱼类暴发性出血症却是一个例外，经常引起同一水体中多种养殖鱼类同时大规模暴发性死亡(又称为运动型气单胞菌败血症Motile Aeromonas Septicemia，MAS)，这种嗜水气单胞菌显示出强大的致病性。成为我国危害最大的鱼类细菌性疾病。这些嗜水气单胞菌菌株被认为是致病性嗜水气单胞菌(virulent Aeromonas hydrophila)。由于嗜水气单胞菌间存在巨大的异质性，不同的致病性菌株被发现携带不一样的毒力基因组合，环境中的无致病性菌株也常携带不止一种甚至多种毒力基因。气单胞菌的分类和鉴定非常复杂，但近年来随着分子生物学技术的发展，对气单胞菌的分类鉴定和分型技术取得了重大突破。大量研究结果显示，这些来自暴发病病例的菌株其基因型都属于ST251型。这些菌株在毒力基因谱、对斑马鱼的LD50以及血清型等方面也非常一致，可以认为属于同一克隆。从2009年开始，一种由嗜水气单胞菌引起的暴发性疾病在美国的斑点叉尾鮰养殖地区发生，造成了巨大的经济损失，经比较发现其病原也是ST251型嗜水气单胞菌。显然，ST251
型嗜水气单胞菌与其他ST型嗜水气单胞菌是不同的。分子生物学技术已经证明是最有效的细菌检测、鉴定技术，具有简便、快速、廉价、灵敏和特异性强的特点。结合传统的细菌分离、培养技术，已成为细菌学研究的基本技术。关于致病性嗜水气单胞菌的检测和鉴定，有许多文献和专利技术都报道了相关的PCR检测技术。然而，这些技术都是针对该菌的某个或某些毒力基因而设计，如溶血素基因、气溶素基因，肠毒素基因等。正如前文所述，嗜水气单胞菌具有很大的异质性，虽然这些基因在ST251型嗜水气单胞菌普遍存在，但在许多非致病性菌株中也有分布，甚至在其它种类的气单胞菌中也同样存在。所以，这样的检测技术无法区分ST251型嗜水气单胞菌和其它类群的嗜水气单胞菌。传统的基于表型的细菌鉴定和检测技术存在明显的技术劣势，如费时、费力和准确性不稳定。很多文献报道或专利技术所介绍的PCR检测方案，在甄别致病性嗜水气单胞菌方面是个空白，特别是还没有专门针对ST251型致病性嗜水气单胞菌的PCR检测技术。而这个类群的嗜水气单胞菌是鱼病学领域重点关注课题之一，对它的检测和鉴定是相关疾病诊断和流行病学研究等必要技术手段。
技术实现思路
本专利技术的目的是在于提供了一种检测ST251型致病性嗜水气单胞菌的试剂盒，这个类群的嗜水气单胞菌都具有强致病性，是淡水鱼类暴发病(细菌性败血症)的病原菌。这种致病菌在水产上的危害极大，侵害鱼类的种类多，是最重要最常见的鱼类病原细菌。本专利技术的另一个目的在于提供了一种检测ST251型嗜水气单胞菌的PCR试剂盒在制备治疗或预防淡水养殖鱼类暴发病药物中的应用。在实施过程中无需特殊的试剂，并提供了阳性对照和阴性对照DNA模板，可以防止出现假阳性和假阴性扩展。适用于目前市场上所有类型的基因扩增仪，检测特异性强、灵敏度高、快速而准确、稳定性好。可用于水产养殖过程中淡水鱼类暴发病和其它鱼类(如斑点叉尾鮰，罗非鱼、鳜鱼等)由嗜水气单胞菌引起的败血症的快速诊断、细菌快速检测和鉴定，并继而在疾病的预测、预报以及流行病学研究中得到广泛应用。为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术措施：本专利技术的技术构思是：通过对多株ST251型嗜水气单胞菌进行基因组测序，另外从Genbank数据中下载多个嗜水气单胞菌全基因组序列，通过比较基因组学
研究，我们发现一种脱氢酶编码基因是ST251型致病性嗜水气单胞菌所独有的，在非致病性和其他类型致病性嗜水气单胞菌中均不存在。为此，我们针对这个基因设计特异性PCR扩增引物，进行试验和不断地优化。通过对15株库存的不同菌株和若干门诊病例菌株的反复检测，证实了这对引物在检测、鉴定ST251型致病性嗜水气单胞菌中的高度特异性。在此基础，我们建立了相应的检测试剂盒，用于淡水鱼类细菌性败血症和斑点叉尾鮰败血症的快速诊断，病原的快速检测和鉴定。通过比较基因组学研究发现，没有哪种目前报道的所谓毒力基因是某个类群所独有，环境菌株的基因组上也含有毒力基因。相关的文献分析也证实了这一点。因此，不难理解针对毒力基因的检测结果容易出现假阳性，而本专利技术就克服了这个缺点，而且经过大量的实验予以了证实。本专利技术提供的检测方法，不仅能够应用于已经分离纯化的细菌样品的鉴定，也可以应用于病鱼血液样品、组织样品、水样、池塘底泥样品以及饲料样品中致病性嗜水气单胞菌的检测。一种检测ST251型嗜水气单胞菌的PCR试剂盒，该试剂盒的内容包括：a.PCR premix：一种冻干的PCR预混合物，包含高保真DNA聚合酶、dNTPs、MgCl2、反应缓冲液、PCR反应增强剂和稳定剂；b.引物对；c.标准阳性DNA模板；d.标准阴性DNA模板；e.灭菌双蒸水。其特征在于：上游引物序列为5’-GCGGCGTAAGCGGATTTGTAGC-3’，下游引物序列为5’-CCGGTCGGATTGGTCAGGTTCAT-3’，退火温度为63℃，正确的扩增产物大小为826bp。标准阳性DNA模板为ST251型嗜水气单胞菌XS91-4-1株的基因组DNA提取物，DNA浓度为500ng/μl；阴性DNA模板为维氏气单胞菌(Aeromonas veronii IB340株)的基因组提取物，DNA浓度为500ng/μl。阳性和阴性对照菌株均为申请者所在实验室自己分离、鉴定和保存的菌株。所述的引物对是借助DNAstar软件中的引物设计板块PimerSelect来完成的，从中选择10对最理想的引物再进行Blast比对分析，筛选得到如下特异性最高的引物对：
上游引物序列为5’-GCGGCGTAAGCGGATTTGTAGC-3’；下游引物序列为5’-CCGGTCGGATTGGTCAGGTTCAT-3’。一种检测ST251型嗜水气单胞菌的PCR试剂盒在制备治疗或预防淡水养殖鱼类暴发病药物中的应用。其使用步骤是：1.需要对待检样品进行前处理，以提取其中的总DNA用于采用本专利技术提供的试剂盒进行检测。本专利技术提供的检测本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测ST251型嗜水气单胞菌的PCR试剂盒，该试剂盒含有： a) PCR premix ：一种冻干的PCR预混合物，包含高保真DNA聚合酶、dNTPs、MgCl2、反应缓冲液、PCR反应增强剂和稳定剂；b) 引物对；c) 标准阳性DNA 模板；d）标准阴性DNA 模板；e)灭菌双蒸水；其特征在于：上游引物序列为5’‑GCGGCGTAAGCGGATTTGTAGC‑3’，下游引物序列为5’‑CCGGTCGGATTGGTCAGGTTCAT‑3’， 退火温度为63℃，扩增产物大小为826bp，标准阳性DNA 模板为ST251型嗜水气单胞菌XS91‑4‑1株的基因组DNA提取物，DNA浓度为500ng/μl；阴性DNA模板为维氏气单胞菌IB340株的基因组提取物，DNA浓度为500ng/μl。
【技术特征摘要】
1.一种检测ST251型嗜水气单胞菌的PCR试剂盒，该试剂盒含有： a) PCR premix ：一种冻干的PCR预混合物，包含高保真DNA聚合酶、dNTPs、MgCl2、反应缓冲液、PCR反应增强剂和稳定剂；b) 引物对；c) 标准阳性DNA 模板；d）标准阴性DNA 模板；e)灭菌双蒸水；其特征在于：上游引物序列为5’-GCGGCGTAAGCGGATTTGTAGC-3’，下游引物序列为5’-CCGGT...
【专利技术属性】
技术研发人员：李爱华，刘天强，彭波，张倩倩，
申请(专利权)人：中国科学院水生生物研究所，
类型：发明
国别省市：湖北;42
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