本发明专利技术介绍了一种对ADP‑核糖基化蛋白质具有分子识别功能的核‑壳结构的分子印迹聚合物微球的制备方法。首先通过可逆加成—断裂链转移（RAFT）沉淀聚合反应制备出表面带有链转移基团的聚苯乙烯微球内核；然后将模板、功能单体、交联剂和引发剂加入到含有聚苯乙烯微球内核的反应溶剂中进行第二步聚合反应，从而使得微球表面形成一层较薄的分子印迹外壳层；最后使用洗脱剂将模板分子移除后，在微球表面的分子印迹薄层中留下模板分子的印迹空穴，得到可用于对ADP‑核糖基化蛋白质的特异性识别与富集的分子印迹材料。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子印迹功能材料
，是一种基于分子印迹技术制备对ADP-核糖基化蛋白具有特异识别功能的聚合物材料，可用于ADP-核糖基化蛋白的专一性识别与分离。
技术介绍
二磷酸腺苷核糖基化（ADP-ribosylation）是一种蛋白质的翻译后修饰过程，即通过腺苷二磷酸核糖基转移酶将二磷酸腺苷核糖基团从NAD+转移到翻译后的目标蛋白质。这种蛋白质翻译后修饰涉及到很多重要的细胞过程，包括DNA修复、转录、翻译、细胞信号传导以及细胞凋亡，研究发现此过程还与很多疾病的产生相关，例如癌症、糖尿病、神经退行性疾病和心脏衰竭。因此，ADP-核糖基化具有重要的临床治疗意义。为了理解ADP-核糖基化的机制，对于ADP-核糖基化蛋白质进行识别和富集就变得非常重要。目前，已经开发出识别或富集ADP-核糖基化蛋白质的方法包括：使用NAD+及其衍生物[J. Zhang, S. H. Snyder， Biochemistry 《生物化学》 1993, 32, 2228-2233；J. Zhang, Methods Enzymol.《方法酶学》. 1997, 280, 255-265],重组大分子结构域[N. Dani, A. Stilla, A. Marchegiani, A. Tamburro, S. Till, A. G. Ladurner, D. Corda, M. Di Girolamo, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 《美国科学院进展》. 2009, 106, 4243-4248],抗ADP-核糖基抗体[T. Lischke, V. Schumacher, J. Wesolowski, R. Hurwitz, F. Haag, F. Koch‐Nolte, H. W. Mittrücker, Eur. J. Immunol.《欧洲免疫学杂志》 2013, 43, 1828-1838],以及对于ADP-核糖基化蛋白质具有高亲和力的物质（例如磷酸盐亲和材料和硼酸盐亲和材料）[H. Okayama, K. Ueda, O. Hayaishi, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.《美国科学院进展》1978, 75, 1111-1115]。然而，由于这种蛋白质翻译后修饰的动态性、异构性和不稳定性，没有任何一种单一的方法可以适用于所有类型的ADP-核糖基化过程，因此就需要研究有效识别或富集ADP-核糖基化蛋白质的新方法和新材料。分子印迹技术（Molecular Imprintitng Technique，MIT）[G. Wulff, A. Sarhan, Angew. Chern. Int. Ed.《德国应用化学》1972, 11, 341-345；G. Vlatakis, L. I. Andersson, R. MUller, K. Mosbach, Nature 《自然》1993, 361, 645-647]也叫分子模板技术，属于超分子化学研究范畴，是一种合成具有仿生识别功能的高分子聚合物的方法，即以某一特定的目标分子为模板，制备出对该分子有特异选择性的聚合物的过程，这种高分子聚合物被称为分子印迹聚合物（Molecularly Imprinted Polymer，MIP）。由于其具有较好的稳定性和较低的成本，分子印迹聚合物被认为是潜在的生物识别分子（例如抗体和受体）的替代材料，并且已被发现其可应用于分离、传感、催化和药物设计等多个方面[姜忠义, 吴洪.《分子印迹技术》, 北京: 化学工业出版社, 2003]。虽然，已有报道利用分子印迹技术制备可特异识别目标蛋白的分子印迹聚合物[W. Zhang, W. Liu, P. Li, H. Xiao, H. Wang, B. Tang, Angew. Chem. Int. Ed. 《德国应用化学》 2014, 53, 12489-12493; X.L. Zhao, D.Y. Li, X.W. He, W.Y. Li, Y.K. Zhang, J. Mater. Chem. B 《材料化学杂志》 2014, 2, 7575-7582，S. Shinde, A. Bunschoten, J. A. W. Kruijtzer, R. M. J. Liskamp, B. Sellergren, Angew. Chem. Int. Ed. 《德国应用化学》 2012, 51, 8326-8329; Z. Bie, Y. Chen, J. Ye, S. Wang and Z. Liu, Angew. Chem. Int. Ed. 《德国应用化学》 2015, 54, 10211-5] ，但是对于可识别ADP-核糖基化蛋白质的分子印迹聚合物尚未见报道。
技术实现思路
为了克服现有方法的不足，本专利技术提供了一种可特异识别ADP-核糖基化蛋白质的核壳型分子印迹聚合物微球的制备方法，它是利用分子印迹技术制备仿抗体分子识别性能的功能性材料。为获得上述可特异识别ADP-核糖基化蛋白质的核壳型分子印迹聚合物微球，本专利技术的技术方案如下：首先通过可逆加成—断裂链转移（RAFT）沉淀聚合反应制备出表面带有链转移基团的聚苯乙烯微球内核；然后将模板、功能单体、交联剂和引发剂加入到含有聚苯乙烯微球内核的反应溶剂中进行第二步聚合反应，从而使得微球表面形成一层较薄的分子印迹外壳层；最后使用洗脱剂将模板移除后，将会在微球表面的分子印迹薄层中留下模板分子的印迹空穴。优选地，如上所述的可逆加成—断裂链转移（RAFT）沉淀聚合反应可以是光引发、或者热引发。优选地，如上所述的一种可识别ADP-核糖基化蛋白的分子印迹聚合物微球的制备方法，聚苯乙烯微球内核的制备中加入聚合单体、交联剂的摩尔比为1:3~5，功能单体、交联剂在反应体系中的体积百分数1~5%；引发剂的量为聚合单体和交联剂总量的0.5~2%，引发剂与链转移剂的摩尔比1:3~9，链转移剂与引发剂的总量为聚合单体和交联剂总量的3~10%。优选地，如上所述的一种可识别ADP-核糖基化蛋白的分子印迹聚合物微球的制备方法，聚苯乙烯微球内核的制备条件：聚合反应前，反应体系通氩气或者氮气5~60min，除氧，然后在氩气或者氮气气氛下反应3~12小时、反应温度60~70°C。优选地，如上所述的一种可识别ADP-核糖基化蛋白的分子印迹聚合物微球的制备方法，分子印迹壳层的制备是将模板分子、功能单体、交联剂和引发剂加入到含有聚苯乙烯微球内核的反应体系中，通过第二步聚合反应在聚苯乙烯微球形成一层较薄的分子印迹外壳层。其中功能单体、交联剂的摩尔比为1:3~5，功能单体、交联剂在反应体系中的体积百分数1~5%，引发剂的量为功能单体和交联剂总量的0.3~2%，模板分子与功能单体的摩尔比1:1~4、聚苯乙烯微球内核的用量50~200mg，所用模板为腺苷（A），或者单磷酸腺苷（AMP）, 或者双磷酸腺苷（ADP），或者三磷酸腺苷（ATP）中的一种。优选地，如上所述的一种可识别ADP-核糖基化蛋白的分子印迹聚合物微球的制备方法，所用的功能单体为：丙烯酰胺、甲基丙烯酸、甲基丙烯酸甲酯、4-乙烯吡啶、2-乙烯吡啶中的一种。优选地，如上所述的一种可本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种可识别ADP‑核糖基化蛋白的分子印迹聚合物微球的制备方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：(1)聚苯乙烯微球的制备：通过聚合单体的可逆加成—断裂链转移沉淀聚合反应制备出表面带有链转移基团的聚苯乙烯微球内核，所述的聚合单体是苯乙烯、丙烯酰胺、乙烯吡啶中的一种；(2)分子印迹壳层的制备：将模板分子、功能单体、交联剂和引发剂加入到含有聚苯乙烯微球内核的反应溶剂中进行聚合反应，使得微球表面形成一层分子印迹外壳层，所述的模板分子是ADP‑核糖基化蛋白质的核糖基部分，是腺苷(A)，或者单磷酸腺苷(AMP)，或者双磷酸腺苷(ADP)，或者三磷酸腺苷(ATP)中的一种；(3)模板分子移除：使用洗脱剂将步骤(2)的壳层中的模板分子移除，在微球表面的分子印迹薄层中留下模板分子的印迹空穴。
【技术特征摘要】
1.一种可识别ADP-核糖基化蛋白的分子印迹聚合物微球的制备方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：(1)聚苯乙烯微球的制备：通过聚合单体的可逆加成—断裂链转移沉淀聚合反应制备出表面带有链转移基团的聚苯乙烯微球内核，所述的聚合单体是苯乙烯、丙烯酰胺、乙烯吡啶中的一种；(2)分子印迹壳层的制备：将模板分子、功能单体、交联剂和引发剂加入到含有聚苯乙烯微球内核的反应溶剂中进行聚合反应，使得微球表面形成一层分子印迹外壳层，所述的模板分子是ADP-核糖基化蛋白质的核糖基部分，是腺苷(A)，或者单磷酸腺苷(AMP)，或者双磷酸腺苷(ADP)，或者三磷酸腺苷(ATP)中的一种；(3)模板分子移除：使用洗脱剂将步骤(2)的壳层中的模板分子移除，在微球表面的分子印迹薄层中留下模板分子的印迹空穴。2.如权利要求1所述的一种可识别ADP-核糖基化蛋白的分子印迹聚合物微球的制备方法，其特征在于：步骤(1)的聚苯乙烯微球的制备方法为：(1)聚合单体、交联剂、链转移剂以及引发剂溶解后、混合均匀制成反应体系，在室温下磁力搅拌10min后，持续抽真空和通入氮气或氩气5-60min；(2)将步骤(1)的反应体系继续放置在磁力搅拌器上持续搅拌，60-70℃下反应3～12h，制备聚苯乙烯微球；(3)使用有机相滤膜真空抽滤步骤(2)的聚苯乙烯微球，除去溶剂，然后将滤膜上的白色固体转移至装有甲醇的容器中，磁力搅拌洗脱30～60min，重复洗脱四次，最后收集滤膜上已干燥的白色粉末。3.如权利要求1所述的一种可识别ADP-核糖基化蛋白的分子印迹聚合物微球的制备方法，其特征在于：步骤(2)的分子印迹壳层的制备方法为：(1)模板分子、功能单体、交联剂、引发剂溶解后，与聚苯乙烯微球混合均匀制成反应体系，在室温下磁力搅拌10min后，持续抽真空和通入氮气或氩气5-60min；(2)将步骤(1)的反应体系继续放置在磁力搅拌器上持续搅拌，60-70℃下反应3～12h，制备腺苷分子印迹聚合物。4.如权利要求1所述的一种可识别ADP-核糖基化蛋白的分子印迹聚合物微球的制备方法，其特征在于：步...
【专利技术属性】
技术研发人员：谢卫红，唐彪，刘静静，
申请(专利权)人：湖北工业大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42
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