一种桑树根际高效解无机磷细菌的培养方法技术

本发明专利技术公开了一种桑树根际高效解无机磷细菌的培养方法，该方法在相同条件下培养，将3株高效解无机磷细菌培养至稳定期后，测定菌体的生长量和菌株的解磷能力，从而筛选出最适pH值为6.0‑7.5，最适装液量范围为100‑125mL。该优化条件的获得为高效解磷微生物的应用提供技术支撑。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于微生物生态学
，涉及一种桑树根际高效解无机磷细菌的培养方法。
技术介绍
磷是植物生长必需的营养元素之一，是植物体内许多重要有机化合物的组分，同时又以多种方式参与植物体内各种新陈代谢，对植物的生长发育起重要的作用。世界上绝大多数土壤缺乏活性磷，土壤中95％-99％的磷无无效形式，植物很难直接吸收利用。土壤中存在大量能够将植物难以吸收利用的磷转化为可吸收利用形态的微生物，即解磷菌或称溶磷菌。有人把其中能够矿化有机磷化合物的称之为解有机磷微生物，将能够把植物难以吸收利用的无机磷酸盐转化为可直接吸收利用形态的微生物，称之为解无机磷微生物。利用微生物的解磷作用能够将难溶性的磷酸盐转化为可溶性磷。土壤中的解磷微生物一方面具有活化难溶性磷的作用，另一方面还具有促进地上作物生长的效果，对于农业生产具有重大的理论和实践意义。许多研究表明，利用解磷细菌制成的菌肥施入土壤后，不仅能够提高土壤有效磷含量，而且能够提高土壤中硝化细菌和其它有益微生物的活性，改善根部营养，能够提高水稻、小麦、玉米、莴苣、甘蓝等农作物的产量。且前苏联、加拿大、印度、日本等国已将解磷菌制成解磷肥料或菌剂应用于生产。目前，我国农业生产主要通过施入无机磷肥的施肥方式来补充植物对磷的需求，但是植物对磷肥的利用率却很低，因此长期施用化学磷肥，一方面会导致大量磷素在土壤中积累，造成磷资源的浪费，另一方面引起土壤中各种养分的失衡，最终将会影响植物的生长。而解磷细菌可以将难溶性磷转化为植物可以直接吸收利用的可溶性磷，提高磷肥利用率，尤其是植物根际解磷细菌对植物生长起到一定程度的促生作用。利用解磷细菌制成生物菌肥具有重大的开发应用价值。现有技术中还没有一种最优培养条件的桑树根际高效解无机磷细菌的培养方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服上述技术存在的缺陷，提供一种桑树根际高效解无机磷细菌的培养方法，从桑园土壤中分离到3株高效解无机磷细菌菌株，并采用摇瓶发酵法确定了该3株
菌株的最适培养条件，为高效解无机磷细菌的应用提供理论依据和技术支撑。一种桑树根际高效解无机磷细菌的培养方法，包括以下步骤：步骤1：高效解磷微生物的分离：从不同施肥桑树根际土壤中分离到3株高效解无机磷细菌W1、W2、W3；步骤2：高效解无机磷细菌生长曲线的测定：3株供试菌株在牛肉膏蛋白胨琼脂平板培养基上28℃培养24h，挑取一环接种于30mL灭菌肉膏蛋白胨液体培养基中，于28℃150r/min摇床上培养12h，制备成1×108cfu/mL悬浮菌液；在250mL的三角瓶中装入100mL的磷酸三钙无机磷培养基，灭菌冷却后；每瓶分别接种1mL 1 108cfu/mL解无机磷细菌悬浮菌液，3次重复，于28℃150r/min摇床上培养，定时取样，利用比浊法测定菌体生长量，绘制生长曲线；步骤3：碳源、氮源的筛选：以葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、甘露醇为碳源，以酵母粉、牛肉膏、尿素、NH4NO3、(NH2)SO4为氮源，在相同的条件下，将3株高效解无机磷细菌培养至稳定期后，测定菌体的生长量和菌株的解磷能力，从而筛选出最适碳源和氮源种类；步骤4：最佳pH值筛选：使用pH计调节磷酸三钙无机磷培养基的pH值为5.0～8.5，以0.5为梯度设置8个pH值点，在相同的条件下，将3株高效解无机磷细菌培养至稳定期后，测定菌体的生长量和菌株的解磷能力，从而筛选出最适pH值范围；步骤5：最佳装液量的确定：在250mL三角瓶中，分别装入25mL、50mL、75mL、100mL、125mL、150mL、175mL、200mL的磷酸三钙无机磷培养基，在相同的条件下，将3株高效解无机磷细菌培养至稳定期后，测定菌体的生长量和菌株的解磷能力，从而筛选出最适装液量范围。优选地，所述磷酸三钙无机磷培养基为：葡萄糖10g，酵母粉0.5g，氯化钙0.1g，硫酸镁0.25g，磷酸三钙10g，蒸馏水1000mL，pH 7.0，分装后灭菌30分钟。优选地，所述牛肉膏蛋白胨琼脂平板培养基为：牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂15-18.0g，蒸馏水1000mL，pH 7.0～7.5。与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：本专利技术从不同施肥桑园土壤中分离到3株高效解无机磷细菌菌株，经Biolog微生物鉴定系统(MicroStationTM,USA)鉴定为Acinetobacter baumannii/gs3、Enterobacter cloacae ss dissolvens、Pantoea agglomerans bgp5，并对此3株菌株的最优培养条件进行优化，确定了3株菌株的最优培养条件，最适碳源为葡萄糖，最适氮源为硝酸铵，最适pH值为6.0-7.5，最适装液量范围为100-125mL，为解磷细菌资源的利用提供理论依据。附图说明图1是三株高效解无机磷细菌的生长曲线；图2是碳源对解无机磷细菌生长和解磷能力的影响，其中图2a为菌体的生长量，图2b为菌株的解磷能力；图3是氮源对解无机磷细菌生长及解磷能力的影响，其中图3a为菌体的生长量，图3b为菌株的解磷能力。具体实施方式为了使本专利技术实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合附图和具体实例进一步阐述本专利技术。一种桑树根际高效解无机磷细菌的培养方法，包括以下步骤：①高效解磷微生物的分离：从不同施肥桑树根际土壤中分离到3株高效解无机磷细菌W1、W2、W3，经Biolog微生物鉴定系统(MicroStationTM,USA)鉴定为Acinetobacter baumannii/gs3、Enterobacter cloacae ss dissolvens、Pantoea agglomerans bgp5。②高效解无机磷细菌生长曲线的测定：3株供试菌株在牛肉膏蛋白胨琼脂平板培养基上28℃培养24h，挑取一环接种于30mL灭菌肉膏蛋白胨液体培养基中，于28℃150r/min摇床上培养12h，制备成1×108cfu/mL悬浮菌液。在250mL的三角瓶中装入100mL的磷酸三钙无机磷培养基，灭菌冷却后；每瓶分别接种1mL 1×108cfu/mL Acinetobacter baumannii/gs3、Enterobacter cloacae ss dissolvens及Pantoea agglomerans bgp5的细菌悬浮菌液，每个菌株3次重复，于28℃150r/min摇床上培养，定时取样，利用比浊法测定菌体生长量，绘制生长曲线，如图1所示。③碳源、氮源的筛选：以葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、甘露醇为碳源，以酵母粉、牛肉膏、尿素、NH4NO3、(NH2)SO4为氮源，每100mL接种1mL 108cfu/mL浓度的菌悬液，于28℃150r/min摇床上培养，将3株高效解无机磷细菌培养至稳定期后，测定菌体的生长量和菌株的解磷能力，从而筛选出最适碳源为葡萄糖(图2)，最适氮源为硝酸铵(图3)。④最佳pH值筛选：使用pH计调节磷酸三钙无机磷培养基的pH值为5.0～8.5，以0.5为梯度设置8个pH值点，每100mL接种1mL 108cfu/mL浓度的菌悬液，于28℃150r/min摇床上培养，将3株高效解无机磷细菌培养至稳定期后，测定菌体的生长量和本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种桑树根际高效解无机磷细菌的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1：高效解磷微生物的分离：从不同施肥桑树根际土壤中分离到3株高效解无机磷细菌W1、W2、W3；步骤2：高效解无机磷细菌生长曲线的测定：3株供试菌株在牛肉膏蛋白胨琼脂平板培养基上28℃培养24h，挑取一环接种于30mL灭菌肉膏蛋白胨液体培养基中，于28℃150r/min摇床上培养12h，制备成1×108cfu/mL悬浮菌液；在250mL的三角瓶中装入100mL的磷酸三钙无机磷培养基，灭菌冷却后；每瓶分别接种1mL 1 108cfu/mL解无机磷细菌悬浮菌液，3次重复，于28℃150r/min摇床上培养，定时取样，利用比浊法测定菌体生长量，绘制生长曲线；步骤3：碳源、氮源的筛选：以葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、甘露醇为碳源，以酵母粉、牛肉膏、尿素、NH4NO3、(NH2)SO4为氮源，在相同的条件下，将3株高效解无机磷细菌培养至稳定期后，测定菌体的生长量和菌株的解磷能力，从而筛选出最适碳源和氮源种类；步骤4：最佳pH值筛选：使用pH计调节磷酸三钙无机磷培养基的pH值为5.0～8.5，以0.5为梯度设置8个pH值点，在相同的条件下，将3株高效解无机磷细菌培养至稳定期后，测定菌体的生长量和菌株的解磷能力，从而筛选出最适pH值范围；步骤5：最佳装液量的确定：在250mL三角瓶中，分别装入25mL、50mL、75mL、100mL、125mL、150mL、175mL、200mL的磷酸三钙无机磷培养基，在相同的条件下，将3株高效解无机磷细菌培养至稳定期后，测定菌体的生长量和菌株的解磷能力，从而筛选出最适装液量范围。...

【技术特征摘要】
1.一种桑树根际高效解无机磷细菌的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1：高效解磷微生物的分离：从不同施肥桑树根际土壤中分离到3株高效解无机磷细菌W1、W2、W3；步骤2：高效解无机磷细菌生长曲线的测定：3株供试菌株在牛肉膏蛋白胨琼脂平板培养基上28℃培养24h，挑取一环接种于30mL灭菌肉膏蛋白胨液体培养基中，于28℃150r/min摇床上培养12h，制备成1×108cfu/mL悬浮菌液；在250mL的三角瓶中装入100mL的磷酸三钙无机磷培养基，灭菌冷却后；每瓶分别接种1mL 1 108cfu/mL解无机磷细菌悬浮菌液，3次重复，于28℃150r/min摇床上培养，定时取样，利用比浊法测定菌体生长量，绘制生长曲线；步骤3：碳源、氮源的筛选：以葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、甘露醇为碳源，以酵母粉、牛肉膏、尿素、NH4NO3、(NH2)SO4为氮源，在相同的条件下，将3株高效解无机磷细菌培养至稳定期后，测定菌体的生长量和菌株的解磷能力，从而筛选出最适碳源和氮源种类；步骤4：最佳pH值筛选：使用pH计...

【专利技术属性】
技术研发人员：于翠，胡兴明，邓文，李勇，熊超，莫荣利，
申请(专利权)人：湖北省农业科学院经济作物研究所，
类型：发明
国别省市：湖北;42