本发明专利技术提供一种高稳定性假病毒颗粒及其制备所用的质粒载体和方法。所述假病毒颗粒内含有诺如病毒的核酸片段，所述核酸片段能用于作为检测诺如病毒的靶标。所述质粒载体含有包括Qbeta噬菌体的成熟酶编码基因、衣壳蛋白编码基因、包装位点序列以及所述核酸片段对应的cDNA序列在内的DNA片段。所述方法包括构建所述质粒载体，然后将质粒载体在大肠杆菌细胞中进行转录和/或翻译，接着分离纯化得到假病毒颗粒。通过本发明专利技术的方法可以制备内含能用于作为检测靶标的诺如病毒核酸片段的假病毒颗粒，其具有无传染性、拷贝数高、稳定性好等优点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，具体涉及一种内含有诺如病毒核酸片段的高稳定性假病毒颗粒及其制备所用的质粒载体和方法。
技术介绍
诺如病毒(Norovirus，NoV)发现于1972年，属于杯状病毒科、诺如病毒属，被世界卫生组织划定为B类病原体，是导致不同年龄阶段人群急性病毒性腹泻的最主要病原之一。诺如病毒在环境中稳定存在，只需要很小的感染剂量即可致病，可以通过污染的水源、食物、空气等传播，因此常常引起严重的公共卫生问题和食品安全问题。根据诺如病毒依赖于RNA的RNA聚合酶和衣壳蛋白编码基因序列的相似度，将诺如病毒分为GI、GII、GIII、GIV、GV共5个基因组。RT-PCR方法与real-time RT-PCR方法由于具有灵敏度高、重复性好、检测过程快捷等优点，目前成为诺如病毒检测的“金标准”方法。但是，由于诺如病毒目前不能进行体外细胞培养，real-time RT-PCR等分子生物学方法均没有统一的标准样品作为阳性对照，无法开展病毒提取过程与检测结果的评价。综合国内外的参考文献、我国行业标准、国际标准，大多建议使用阳性腹泻样本作为阳性标准样品，但腹泻样本作为阳性标准样品有以下两个重大缺点：(1)病毒含量不均一，不同患者的腹泻样本中的病毒浓度可能相差数十倍、数百倍，不能用于检测方法灵敏度评价、不同实验室检测结果比对等重要环节；(2)存在严重的生物安全隐患，以活病毒为阳性对照，存在操作人员感染继而引发大范围传染的可能。因此，急需研发一种稳定性好、与病毒高度相似、无生物安全隐患、适用于国际检测标准的标准品。现有技术文献耐核糖核酸酶病毒样颗粒的构建和表达.李金明，宋如俊，王露楠，邓巍.中华检验医学杂志，2003年2月第26卷第2期，86-88页
技术实现思路
基于上述问题，本专利技术的目的在于提供一种假病毒颗粒，所述假病毒颗粒基于Qbeta噬菌体的衣壳蛋白而构建获得，且其中包含有诺如病毒的核酸片段，所述核酸片段能用于作为检测诺如病毒例如GII型诺如病毒的靶标。所述假病毒颗粒内含有诺如病毒的核酸片段，所述核酸片段能用于作为检测诺如病毒的靶标。优选地，所述核酸片段是与序列表中SEQ ID No.2的DNA序列相对应的RNA。优选地，所述假病毒颗粒通过质粒载体在大肠杆菌细胞中进行转录和/或翻译表达而制得，所述质粒载体中含有包括Qbeta噬菌体的成熟酶编码基因、衣壳蛋白编码基因、包装位点序列以及诺如病毒的核酸片段对应的cDNA在内的DNA片段。所述核酸片段对应的cDNA序列优选是序列表中SEQ ID No.2的DNA序列，所述DNA片段优选具有序列表中SEQ ID No.1所示的序列。优选地，所述质粒载体利用了原核表达载体pET-28a(+)的骨架，所述DNA片段插入到所述原核表达载体pET-28a(+)中，使得所述整体DNA片段能在T7启动子下进行转录和/或翻译。优选地，所述大肠杆菌为大肠杆菌BL21。本专利技术还提供一种用于制备假病毒颗粒的质粒载体，其含有包括Qbeta噬菌体的成熟酶编码基因、衣壳蛋白编码基因、包装位点序列以及诺如病毒的核酸片段对应的cDNA序列在内的DNA片段。所述核酸片段对应的cDNA序列优选是序列表中SEQ ID No.2的DNA序列，所述DNA片段优选具有序列表中SEQ ID No.1所示的序列。优选地，所述质粒载体利用了原核表达载体pET-28a(+)的骨架，
所述DNA片段插入到所述原核表达载体pET-28a(+)中，使得所述DNA片段能在T7启动子下进行转录和/或翻译。优选地，所述质粒载体中还包括多克隆位点，所述多克隆位点位于所述DNA片段的表达方向的下游，所述多克隆位点沿所述表达方向依次包括Apa I、Kpn I、Pst I、Spe I、Sph I和Not I。本专利技术还提供一种制备假病毒颗粒的方法，其包括以下步骤：(1)制备包括Qbeta噬菌体的成熟酶编码基因、衣壳蛋白编码基因、包装位点序列和诺如病毒的核酸片段对应的cDNA序列在内的DNA片段；(2)将所述DNA片段克隆至大肠杆菌原核表达载体中，获得质粒载体；(3)将所述质粒载体转化入大肠杆菌感受态细胞中；(4)诱导所述DNA片段在所述大肠杆菌细胞中转录和/或翻译；(5)收集步骤(4)的所述大肠杆菌细胞，并进行破碎，从中纯化得到所述假病毒颗粒。所述核酸片段对应的cDNA序列优选是序列表中SEQ ID No.2的DNA序列，所述DNA片段优选具有序列表中SEQ ID No.1所示的序列。优选地，通过人工合成的方式制备所述DNA片段。优选地，通过同源重组的方式将所述DNA片段克隆至大肠杆菌原核表达载体pET-28a(+)中，获得所述质粒载体。所述大肠杆菌优选为大肠杆菌BL21。优选地，利用异丙基硫代半乳糖苷来诱导所述DNA片段在所述大肠杆菌细胞中进行转录和/或翻译。本专利技术所提供的假病毒颗粒，由于其中包含诺如病毒的核酸片段，该核酸片段能用作检测诺如病毒的靶标，使得所述假病毒颗粒能作为诺如病毒核酸检测的标准阳性样品，应用于医院、食品卫生、质检、科研等检测机构。该核酸片段可以是例如国际标准ISO/T15216-22012所涉及到的GII型诺如病毒检测靶标序列对应的RNA片段，从而能够直接作为国际标准ISO/T15216-2 2012方法的标准阳性样品，与ISO/T15216-2 2012配套使用，解决了现有技术中存在的“有检测方法没有标准样品”、“研发标准样品未对应标准方法导致
适用范围狭窄”、“标准样品与检测方法配套性差”等严重制约诺如病毒检测发展的瓶颈问题。此外，与属于I型的MS2噬菌体相比，属于III型的Qbeta噬菌体的衣壳蛋白的稳定性更高，因此，基于Qbeta噬菌体衣壳蛋白构建的盔甲RNA具有更高的稳定性，更能适用于标准品的制备、运输、储存与使用。本专利技术所提供的质粒载体包括从5'端到3'端依次为Apa I、Kpn I、Pst I、Spe I、Sph I和Not I的多克隆位点，这些酶切位点均在Qbeta克隆片段中缺失，从而可以依据需要十分方便地在该质粒载体aMCS中插入其他RNA对应的cDNA，用于制备其它检测RNA病毒核酸时的标准阳性样品。而且，与这些酶切位点对应的限制性内切酶价格十分便宜，可极大地降低生产成本。利用本专利技术所提供的制备假病毒颗粒的方法，能够方便可靠地获得无传染性、拷贝数高、稳定性好的假病毒颗粒。附图说明图1是具体实施方式中QINVGII片段组成的示意图。图2是具体实施方式中质粒载体pET-QINVGII的图谱示意图。图3是PCR扩增的QINVGII片段产物的琼脂糖凝胶电泳图。图4是质粒载体pET-QINVGII的酶切产物的琼脂糖凝胶电泳图。图5是假病毒颗粒中残留质粒DNA检测的琼脂糖凝胶电泳图，其中泳道M是DNA分子量标准，泳道1是以质粒载体pET-QINVGII为模板的阳性对照的扩增结果，泳道2是以ddH2O为模板的阴性对照的扩增结果，泳道3和4是以待检测的假病毒颗粒为模板的扩增结果。图6是质粒载体pET-QINVGII在大肠杆菌BL21中表达产物的SDS-PAGE电泳图，其中M是蛋白质分子量标准，泳道1是大肠杆菌BL21对照，泳道2是转化有质粒载体pET-QINVGII、本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种假病毒颗粒，所述假病毒颗粒内含有诺如病毒的核酸片段，所述核酸片段能用于作为检测诺如病毒的靶标。
【技术特征摘要】
1.一种假病毒颗粒，所述假病毒颗粒内含有诺如病毒的核酸片段，所述核酸片段能用于作为检测诺如病毒的靶标。2.根据权利要求1所述的假病毒颗粒，其特征在于，所述核酸片段是与序列表中SEQ ID No.2的DNA序列相对应的RNA。3.根据权利要求1所述的假病毒颗粒，其特征在于，所述假病毒颗粒通过质粒载体在大肠杆菌细胞中进行转录和/或翻译表达而制得，所述质粒载体含有包括Qbeta噬菌体的成熟酶编码基因、衣壳蛋白编码基因、包装位点序列以及所述核酸片段对应的cDNA序列在内的DNA片段，其中，所述核酸片段对应的cDNA序列是序列表中SEQ ID No.2的DNA序列，所述DNA片段具有序列表中SEQ ID No.1所示的序列。4.根据权利要求3所述的假病毒颗粒，其特征在于，所述质粒载体利用了原核表达载体pET-28a(+)的骨架，所述DNA片段插入到所述原核表达载体pET-28a(+)中，使得所述DNA片段能在T7启动子下进行转录和/或翻译。5.根据权利要求4所述的假病毒颗粒，其特征在于，所述大肠杆菌为大肠杆菌BL21。6.一种用于制备假病毒颗粒的质粒载体，其含有包括Qbeta噬菌体的成熟酶编码基因、衣壳蛋白编码基因、包装位点序列以及诺如病毒的核酸片段对应的cDNA序列在内的DNA片段。7.根据权利要求6所述的质粒载体，其特征在于，所述核酸片段对应的cDNA序列是序列表中SEQ ID No.2的DNA序列，所述DNA片段具有序列表中SEQ ID No.1所示的序列。8.根据权利要求7所述的质粒载体，其特征在于，所述质粒载体利用了原核表达载体pET-28a(+)的骨架，所述DNA片段插入到所述原核表达载体pET-28a(+)中，使得...
【专利技术属性】
技术研发人员：姚琳，庞倩倩，江艳华，李风铃，朱文嘉，郭莹莹，王联珠，翟毓秀，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院黄海水产研究所，
类型：发明
国别省市：山东;37
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