一种应用自诱导培养基和全细胞催化合成海藻糖的方法。将包含海藻糖合成酶基因的大肠杆菌基因工程菌接种至自诱导培养基中诱导产酶，获取发酵液；从发酵液中提取大肠杆菌基因工程菌湿菌体，用磷酸盐缓冲液重悬，获取反应液；用磷酸盐缓冲液配制麦芽糖溶液，与反应液进行催化反应，后分离干燥获得海藻糖晶体。采用本发明专利技术的方法，自诱导培养基培养出来的细胞不需要经过外源处理，直接在磷酸盐缓冲体系中进行全细胞催化反应合成海藻糖，便可实现高效催化。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种应用自诱导培养基和全细胞催化合成海藻糖的方法，属于功能糖醇合成
技术介绍
海藻糖（Trehalose)又名罩糖，是一种由葡萄糖分子以α，α-1，1-糖昔键相连而成的非还原性二糖，它广泛地存在于微生物、虾类、昆虫、脊椎动物以及植物等之中。海藻糖对于生物体及生物大分子、生物膜等都具有良好的非特异性保护作用，使得细胞对不良环境条件(如高温、冷冻、脱水、高渗透压等)具有高效的抗逆性，因此被誉为“生命之糖”。此外，海藻糖还具有性质稳定、甜度低、人类吸收缓慢以及不形成龋齿的特点。因此，海藻糖被广泛应用于食品、医药、化妆品等精细化学品领域之中。海藻糖的商品化制备始于20世纪40年代捷克用酒精从面包酵母中提取海藻糖。现代的制备方法主要包括化学合成法、微生物发酵法、酶转化法。其中，化学合成法产率低，分离困难，难以工业化；微生物发酵法转化率较低，发酵副产物较多，使得海藻糖的提取、精制困难。酶转化法是目前海藻糖生产的主要途径，许多生物体内部有合成海藻糖的酶系，可以利用基因工程手段高效表达出来，利用这些酶与底物进行催化反应，可以大规模的生产海藻糖。1995年，日本首次实现了酶法制备海藻糖的大规模生产，使海藻糖的价格大幅下降。但是，海藻糖合酶属于胞内酶，酶法生产海藻糖过程中通常要破碎菌体，提取与纯化海藻糖合成酶系，而在破碎及纯化过程中容易造成酶的损失，这无疑加大了企业的生产成本。利用全细胞催化合成海藻糖可以免去细胞破碎工序，提高酶的稳定性和利用率，得到高纯度的产物，从而降低生产成本。但是，由于微生物细胞膜的通透性屏障，使反应底物和产物难以自由出入细胞，生物催化的效率明显低于纯酶催化反应体系。解决这个技术问题的关键是通过对细胞进行通透性处理，增强胞内酶的使用率，从而提高海藻糖在反应体系中的浓度。现有技术中，提高细胞通透性的处理方法主要包括以超声法、冻融法为物理法；有机溶剂和表面活性剂等化学法。物理法的技术原理为通过造成目标细胞细胞壁以及细胞膜的结构性损伤未提高其通透性。例如，文献通过冻干法来破坏细胞的分子结构，可以有效增加细胞的通透性，提高酶的催化活力。(薛璐，马莺.透性化海藻糖合酶的研究[J].食品与发酵工业，2001，28 (1) ： 16-18.) 物理法提高通透性的技术缺陷为工业放大过程比较困难，实际生产中采用物理法提高通透性的技术有待设计与检验。化学法的技术原理为渗透剂透过细胞壁后与细胞膜的脂质反应，通过破坏蛋白质的氢键使之变性，从而破坏细胞的结构和流动性，使细胞膜失去原有的对胞内外物质的传递调控能力。化学法添加的试剂多为毒性极强的有机试剂，例如，甲苯，二甲基亚砜，十六炕基三甲基澳化镜等等。因此，化学法中有毒试剂的残留会给用于食材的海藻糖生产带来极大的安全隐患，而且有机试剂的残留也会给海藻糖的下游分离纯化生产带来极大压力，不利于成本的降低。另外，化学法在增强细胞通透性的同时，还会造成酶的破坏。自诱导(auto-induction)是最早由纽约厄普顿的布鲁克黑文国家实验室的Studier等提出的一种利用培养基中碳源转换而诱导外源基因表达的方法，即首先以葡萄糖为碳源支持大肠杆菌生长至饱和，待葡萄糖消耗殆尽，培养基中另一种成分乳糖在lacY与lacZ的基因产物透过酶 (lactose permease)和β-半乳糖苷酶(galactosidase) 的协助下，乳糖穿过细胞膜并部分转化为异乳糖开启T7表达系统的方法。乳糖除了作为诱导物之外，其代谢产物葡萄糖和半乳糖(半乳糖在gal操纵子的作用下也将转化成葡萄糖) 也可作为细菌生长的碳源。与传统的IPTG (异丙基白D硫代半乳糖苷)诱导方法相比，在接种之后自诱导表达过程不需要对细胞的生长情况进行监测，从而减少了在培养过程中对培养物的处理，极大地方便了高通量筛选。而且，以价格低廉、无毒的乳糖替代价格高昂的IPTG可以大大地降低生产的成本，在重组蛋白的发酵生产中有着重要的意义。本专利技术利用自诱导基培养发酵得到大肠杆菌细胞。在催化的过程中，无需经过外源处理，自诱导培养基培养出来的细胞在磷酸盐缓冲体系下即可以进行全细胞催化底物反应。目前，此种自诱导培养基培养出来的含有胞内酶的细胞不经外源处理，直接在磷酸盐体系下进行全细胞催化的研究尚未见报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种应用自诱导培养基和全细胞催化合成海藻糖的方法。本专利技术不仅利用自诱导发酵体系取代传统的IPTG诱导发酵体系，降低了生产成本，而且利用自诱导培养得到的含有胞内酶的细胞，在不经外源处理的情况下，直接在磷酸盐体系下进行全细胞催化反应，生成海藻糖，提高利用全细胞催化合成海藻糖的效率，从而进一步降低海藻糖的生产成本。为实现上述专利技术目的，本专利技术采用如下技术方案：一种应用自诱导培养基和全细胞催化合成海藻糖的方法，利用自诱导培养基发酵得到产海藻糖合成酶的大肠杆菌基因工程菌细胞，该细胞可直接与麦芽糖底物在磷酸盐缓冲液体系下进行全细胞催化反应，得到富含海藻糖的液体。具体的，本专利技术所述的方法，包括如下步骤：（1）将包含海藻糖合成酶基因的大肠杆菌基因工程菌接种至自诱导培养基中诱导产酶，获取发酵液；（2）从步骤（1）中的发酵液中提取大肠杆菌基因工程菌湿菌体，用磷酸盐缓冲液重悬，获取反应液；（3）用磷酸盐缓冲液配制麦芽糖溶液，与步骤（2）中的反应液进行催化反应，后分离干燥获得海藻糖晶体。优选的，所述大肠杆菌细胞包含来源于灰产色链霉菌Streptomyces griseochromogenes的海藻糖合成酶基因，并能表达合成海藻糖合酶。优选的，所述步骤（1）中，在将大肠杆菌基因工程菌接种至诱导培养基前，还包括活化步骤，具体为：（1）采用划线法于加氨苄的固体LB培养基上培养大肠杆菌基因工程菌，获得大肠杆菌单菌落；挑取单菌落接种于加氨苄的LB液体培养基活化菌种，活化培养条件为37℃，200 rpm，培养时间8-12 h；（2）取所述活化的菌种按接种量1.5% (V/V)接种到加氨苄的LB培养基继续活化，活化培养条件为37℃，200 rpm，培养时间8-12 h。取步骤（2）中活化的菌种按体积比1.5% (V/V)的接种量将菌种接种到自诱导培养基发酵罐中，诱导产酶15-17 h，培养条件为37℃，200 rpm，获得发酵液。优选的，所述加氨苄的固体 LB 培养基配方为：蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，氯化纳10 g/L，氨苄抗生素0.1 g/L，琼脂20 g/L；所述加氨苄的液体LB培养基配方为：蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，氯化钠10 g/L，氨苄抗生素0.1 g/L。所述自诱导发酵培养基配方为：甘油 5 g/L、Na2HPO4 6 g/L、K2HPO4 3 g/L、NH4Cl 1 g/L、NaCl 0.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、大豆蛋白胨10 g/L，氨苄抗生素0.1 g/L。优选的，所述磷酸盐缓冲液的配制方法为：A液（0.04 mol/L NaH2PO4）：称取NaH2PO4•2H2O 6.24 g，蒸馏水溶解，定容至1 L。B液（0.04 mol/L Na2HPO4）：称取Na2HPO4•12H2O 14.32 g，蒸馏水溶解，定本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种应用自诱导培养基和全细胞催化合成海藻糖的方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）将包含海藻糖合成酶基因的大肠杆菌基因工程菌接种至自诱导培养基中诱导产酶，获取发酵液；（2）从步骤（1）中的发酵液中提取大肠杆菌基因工程菌湿菌体，用磷酸盐缓冲液重悬，获取反应液；（3）用磷酸盐缓冲液配制麦芽糖溶液，与步骤（2）中的反应液进行催化反应，后分离干燥获得海藻糖晶体。
【技术特征摘要】
1.一种应用自诱导培养基和全细胞催化合成海藻糖的方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）将包含海藻糖合成酶基因的大肠杆菌基因工程菌接种至自诱导培养基中诱导产酶，获取发酵液；（2）从步骤（1）中的发酵液中提取大肠杆菌基因工程菌湿菌体，用磷酸盐缓冲液重悬，获取反应液；（3）用磷酸盐缓冲液配制麦芽糖溶液，与步骤（2）中的反应液进行催化反应，后分离干燥获得海藻糖晶体。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中，所述大肠杆菌基因工程菌中包含的海藻糖合成酶基因来源于灰产色链霉菌Streptomyces griseochromogenes。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中，在将大肠杆菌基因工程菌接种至诱导培养基前，还包括活化步骤，具体为：（1）采用划线法于加氨苄的固体LB培养基上培养大肠杆菌基因工程菌，获得大肠杆菌单菌落；挑取单菌落接种于加氨苄的LB液体培养基活化菌种，活化培养条件为37℃，200 rpm，培养时间8-12 h；（2）取所述活化的菌种按接种量1.5% (V/V)接种到加氨苄的LB培养基继续活化，活化培养条件为37℃，200 rpm，培养时间8-12 h。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述加氨苄的固体LB培养基配方为：蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，氯化纳10 g/L，氨苄抗生素0.1 g/L，琼脂20 g/L；所述加氨苄的液体LB培养基配方为：蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，氯化钠10 g/L，氨苄抗生素0.1 g/L。5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，取步骤（2）中活...
【专利技术属性】
技术研发人员：江凌，晏星辰，黄和，宋小刚，李阳，宋哲，唐苏苏，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。