本发明专利技术涉及西葫芦花叶病毒的全基因序列及其检测方法。所述西葫芦花叶病毒的基因组经反转录后得到的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。根据病毒全基因序列设计出可快速检测西葫芦花叶病毒的特异性引物和探针，并在此基础上建立了荧光定量PCR检测方法，可从发病植物组织及土壤中复杂的病原菌环境以及携带此病毒的棉蚜体内快速、准确地检测出西葫芦花叶病毒。根据该方法构建的检测试剂盒操作简便，特异性好，灵敏度高，对西葫芦花叶病疫情的早期预警、疫区的病原监测等方面具有重要意义。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及微生物学及分子生物学检测领域，具体地说，涉及西葫芦花叶病毒的全基因序列及其检测方法。
技术介绍
西葫芦病毒病又称花叶病，是葫芦科蔬菜的一个重要病害。据近几年调查，无论是露地栽培还是保护地栽培均有发生，发病严重地块可以造成30％～40％减产。西葫芦病毒病是由多种病毒单独或复合侵染所致。通常症状表现为花叶、皱缩、混合等3种类型。花叶型表现为叶片上出现黄绿不匀的斑驳，可引起全株萎蔫。皱缩型表现为沿新叶叶脉出现浓绿色隆起皱纹或叶片变小，出现蕨叶、裂片，在果面出现花斑或产生凹凸不平的瘤状物，果实多畸形，严重时病株枯死。混合型表现为花叶、皱缩两种混合病症。棉蚜(Aphis gossypii Glover)是广泛分布于世界各国的一种常见害虫，取食和传播植物病毒，对农业生产造成严重影响。已报到的棉蚜传播病毒病种类包括小西葫芦黄花叶病毒病(Zucchini yellow mosaic virus)等多种植物病毒。葫芦科瓜类为棉蚜的主要侨居寄主，这就使得棉蚜作为病毒传毒媒介造成的危害十分严重。棉蚜是西葫芦病毒病传播的主要途径，尽早检测棉蚜携带病毒，对病毒病的防治具有重要的应用价值。对西葫芦病毒病检测鉴定，目前主要有生物学方法、电镜法、血清学方法和分子生物学方法。其中血清学方法具有特异性好、操作简便、检测周期短的特点，但在准确性和灵敏度方面还有一定的缺陷；分子生物学方法具有特异性强、灵敏度高的特点，能够弥补血清学方法的缺点。分子生物学方法需要依据病毒的核酸序列信息。西葫芦花
叶病毒基因信息的获得为开发棉蚜带毒检测方法和西葫芦花叶病毒分子诊断技术的开发提供坚实的基础。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种新的西葫芦花叶病毒及其全基因序列。本专利技术的另一目的是提供上述西葫芦花叶病毒的检测方法。为了实现本专利技术目的，本专利技术的西葫芦花叶病毒，该病毒基因组经反转录后得到的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。含有3个读码框，ORF1、ORF2和ORF3大小分别为7140bp、1416bp和603bp(图1)。本专利技术还提供所述病毒的全基因序列。该病毒属于正链ssRNA病毒，无DNA阶段，属于浓核病毒属(Densovirus)类病毒，染病西葫芦表现为混合类型症状。本专利技术还提供用于检测所述西葫芦花叶病毒的特异性PCR引物，引物序列为15～45个，优选18-24个连续核苷酸，所述引物用于样品经反转录PCR后检测扩增产物。正向引物和反向引物符合Tm值为55-65℃，且二者Tm值相差不超过2℃，GC含量为40％-60％。本专利技术还提供用于检测所述西葫芦花叶病毒的特异性探针，探针序列为15-45个，优选20-30个连续核苷酸，所述探针针对RNA或DNA样品进行检测。所述探针可以与上述引物配合使用。探针的Tm值为65-70℃，通常比引物Tm值高5-10℃(至少高5℃)，GC含量为40％-70％，探针的5’端应避免使用鸟嘌呤。本专利技术还提供用于荧光定量PCR检测所述西葫芦花叶病毒的特异性引物和探针，包括：Primer-F：5’-TTAGGAACGATTCCATTCTT-3’Primer-R：5’-TTCGATCTCACTTATGTAGC-3’Probe：5’-CTCGTCAAGCACACTAAGGCA-3’其中，探针5’端带有荧光基团，3’端带有荧光淬灭基团。本专利技术还提供基于荧光定量PCR技术检测所述西葫芦花叶病毒的方法，即利用上述引物F、R和探针进行荧光定量PCR检测。具体地，所述方法包括以下步骤：1)提取样品中的总RNA，反转录合成cDNA；2)以步骤1)的cDNA为模板，进行荧光定量PCR扩增反应；3)分析扩增产物。其中，荧光定量PCR反应体系为：荧光定量PCR反应程序为：94℃3min；然后98℃10s，68℃60s，40个循环，并且在第2步时收集荧光。本专利技术进一步提供含有所述引物和/或探针的检测试剂盒。本专利技术公开了西葫芦花叶病毒的全基因序列，并根据全基因序列设计出可快速检测该病毒的特异性引物和探针，并在此基础上建立了荧光定量PCR检测方法，可从发病植物组织及土壤中复杂的病原菌环境以及携带此病毒的棉蚜体内快速、准确地检测出西葫芦花叶病毒。根据该方法构建的检测试剂盒操作简便，特异性好，灵敏度高，对西葫芦花叶病疫情的早期预警、疫区的病原监测等方面具有重要意义。附图说明图1为本专利技术西葫芦花叶病毒基因组序列中含有的3个读码框。图2为本专利技术实施例1中构建的西葫芦花叶病毒的系统进化树。图3为本专利技术实施例2中荧光定量PCR扩增情况，其中浓度1-8分别代表1、10、100、200、400、800、1600和3200倍稀释的cDNA样品。具体实施方式以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。实施例1西葫芦花叶病毒全基因序列的获得棉蚜于2011年6月12日采自于中国农业科学院棉花研究所东试验农场棉田(36°5'34.8\N，114°31'47.19\E)。采集后挑选无翅成蚜，置于液氮中速冻，随即进行总RNA提取。利用Illumina的Solexa高通量测序平台构建Paired-End片段库进行表达谱测序。对测得原始数据进行质量控制，步骤为采用滑动窗口法去除低质量片段，切除原始序列中含N部分序列。然后使用软件abyss1.3.0进行Denovo拼接，得到Unigenes。使用Blastn将Unigenes与GenBank中核酸数据库NT(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)进行比对(E-value＜10-5)，同时使用BlastX工具将Unigenes与GenBank中核酸数据库NR进行比对，挑选与病毒有同源关系的序列进行分析。结果获得一条大小为9235bp的病毒基因组序列，不含3’端polyA尾巴。该基因组序列含有3个读码框，ORF1、ORF2和ORF3大小分别为7140bp、1416bp和603bp(图1)。通过摩擦接种试验证明该病毒是一种西葫芦花叶病毒。利用本专利技术病毒基因组ORF1编码的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)，并在GenBank数据库(www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)搜索与其同源性较高的病毒氨基酸序列，获得8种与其相似度较高的病毒氨基酸序列，使用MEGA6.0软件构建系统进化树。结果显示，由病毒基因组序列推导的氨基酸序列与Loreto病毒、Negev病毒等聚在一起，而与已报道的植物病毒有一定的距离(图2)。实施例2荧光定量PCR检测1、特异性引物和探针的设计与合成：根据西葫芦花叶病毒基因组经反转录后得到的核苷酸序列(SEQ ID NO:1)，使用Beacon Designer7.7软件设计用于荧光定量PCR(Taqman)检测该病毒的特异性引物和探针，包括：Primer-F：5’-TTAGGAACGATTCCATTCTT-3’Primer-R：5’-TTCGATCTCACTTATGTAGC-3’Prob本文档来自技高网...
【技术保护点】
西葫芦花叶病毒，该病毒基因组经反转录后得到的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
【技术特征摘要】
1.西葫芦花叶病毒，该病毒基因组经反转录后得到的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。2.权利要求1所述病毒的全基因序列。3.用于检测权利要求1所述病毒的特异性PCR引物，其特征在于，引物序列为15～45个，优选18-24个连续核苷酸，所述引物用于样品经反转录PCR后检测扩增产物。4.根据权利要求3所述的引物，其特征在于，正向引物和反向引物符合Tm值为55-65℃，且二者Tm值相差不超过2℃，GC含量为40％-60％。5.用于检测权利要求1所述病毒的特异性探针，其特征在于，探针序列为15-45个，优选20-30个连续核苷酸，所述探针针对RNA或DNA样品进行检测。6.根据权利要求5所述的探针，其特征在于，所述探针与权利要求2或3所述引物配合使用，其Tm值为65-70℃，GC含量为40％-70％。7.用于荧光定量PCR检测权利要求1所述病毒的特异性引物和探针...
【专利技术属性】
技术研发人员：张帅，崔金杰，
申请(专利权)人：中国农业科学院棉花研究所，
类型：发明
国别省市：河南;41
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