本发明专利技术公开了西瓜CWACO1基因序列的克隆及其功能验证。本发明专利技术的CWACO1蛋白是如下a)或b)的蛋白质：a)氨基酸序列是序列表中序列3的蛋白质；b)将序列表中序列3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且具有相同功能的蛋白质。通过实验证明：CWACO1蛋白具有ACO酶活性，对揭示西瓜果实成熟机制、西瓜品质和耐贮运育种以及解决生产中水脱瓜问题具有重要意义。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，具体涉及西瓜CWACO1基因序列的克隆及其功能验证。
技术介绍
大量研究证实，乙烯与果实软化、类胡萝卜素等色素合成、风味物质累积等成熟特性密切相关，所以历来是果实成熟调控机制研究的主轴和热点(Cara B and Giovannoni JJ 2008；Vijay P et al.2012)。植物体内，乙烯合成是通过Yang式循环完成的。ACS负责催化S-腺苷甲硫氨酸形成1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)，然后ACC经ACO氧化形成乙烯。ACO酶由多基因家族编码而成，ACO酶及其编码基因已被证实是乙烯合成的关键酶和关键基因，通过转化方式沉默ACO基因会引起乙烯合成骤减，造成果实成熟延迟(Adams DO and Yang SF 1979，Lin ZF et al.2009)。西瓜(Citrullus lanatus(Thunb.)Matsum&Nakai var.lanatus)属于非呼吸跃变果实，虽然乙烯合成较少，但是对乙烯非常敏感。外源乙烯刺激或是环境胁迫诱发内源乙烯过量合成，会引发西瓜软化和番茄红素合成加速，并被认为是造成西瓜生产中水脱现象出现的主要原因(Wechter WP et al.2008，Karakurt Y and Huber D 2002)。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种蛋白质。本专利技术提供的蛋白质是如下a)或b)的蛋白质：a)氨基酸序列是序列表中序列3的蛋白质；b)将序列表中序列3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且具有相同功能的蛋白质。其中，序列3由318个氨基酸残基组成。为了使a)中的蛋白质便于纯化，可在序列表中序列3所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。表1、标签的序列上述b)中的蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。上述b)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述b)中的蛋白质的编码基因可通过将序列1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。本专利技术的另一个目的是提供与上述蛋白质相关的生物材料。本专利技术提供的与上述蛋白质相关的生物材料为下述B1)-B5)中的任一种：B1)编码上述蛋白质的核酸分子；B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体或含有B2)所述表达盒的重组载体；B4)含有B1)所述核酸分子的重组菌或含有B2)所述表达盒的重组菌或含有B3)所述重组载体的重组菌；B5)含有B1)所述核酸分子的细胞系或含有B2)所述表达盒的细胞系或含有B3)所述重组载体的细胞系。上述生物材料中，B1)所述核酸分子为如下1)或2)或3)的DNA分子：1)其核苷酸序列是序列表中序列1所示的cDNA分子或序列2所示的DNA分子；2)与1)限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码所述蛋白质的DNA分子；3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白质的DNA分子。其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。其中，序列1由957个核苷酸组成，序列2由1567个核苷酸组成，编码序列3所示的氨基酸序列。本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本专利技术的编码上述蛋白质的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本专利技术分离得到的上述蛋白质编码基因的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码上述蛋白质且具有相同功能，均是衍生于本专利技术的核苷酸序列并且等同于本专利技术的序列。这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本专利技术的编码序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。上述生物材料中，所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。上述生物材料中，含有B3)所述重组载体的重组菌是将含有B1)所述核酸分子的重组载体导入宿主菌中得到的；所述含有B1)所述核酸分子的重组载体是将编码上述蛋白质的核酸分子插入表达载体，得到表达上述蛋白质的载体。在本专利技术的实施例中，所述编码上述蛋白质的核酸分子(即序列表中序列1所示的DNA分子)通过重组载体pET28a-CWACO1导入所述受体植物中。所述重组载体pET28a-CWACO1为将序列1所示的CWACO1插入表达载体pET28a的EcoR I和HindIII酶切位点间，且保持pET28a载体的其他序列不变得到的载体。本专利技术还有一个目的是提供上述蛋白质的新用途。本专利技术提供了上述蛋白质在催化ACC氧化形成乙烯中的应用。本专利技术还提供了上述蛋白质蛋白质在作为ACO酶中的应用。本专利技术的最后一个目的是提供上述蛋白质或上述生物材料的新用途。本专利技术提供了上述蛋白质或上述生物材料在制备ACO酶中的应用。本专利技术还提供了上述蛋白质或上述生物材料在乙烯合成中的应用。本专利技术从西瓜中克隆了一个新的基因CWACO1，通过实验证明：CWACO1蛋白具有ACO酶活性，对揭示西瓜果实成熟机制、西瓜品质和耐贮运育种以及解决生产中水脱瓜问题具有重要意义。附图说明图1为CWACO1进行RACE反应扩增产物的凝胶电泳图。图1A为3’-RACE扩增出一条约350bp产物；图1B为5’-RACE扩增出一条约700bp产物。图2为CWACO1DNA全长(1567bp)扩增产物的凝胶电泳图。图3为对照和IPTG诱导菌液(pET28a-CWACO1/BL21)提取粗蛋白进行SDS-PAGE电泳。其中，粗体蛋白CK表示未加IPTG菌液提取的粗蛋白；粗体蛋白IPTG表示加
IPTG诱导菌液所提取的粗蛋白。图4为CWACO1蛋白的SDS-PAGE图。图5为Bradford法验证CWACO1蛋白是否具有ACO酶生物功能。图5A代表不加CWACO1蛋白的酶反应液的检测结果；图5B代表加入CWACO1蛋白的酶反应液的检测结果。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、CWACO1基因的克隆一、CWACO1基因CDS区的克隆1、RNA的提取及纯化取西本文档来自技高网...
【技术保护点】
蛋白质，是如下a)或b)的蛋白质：a)氨基酸序列是序列表中序列3的蛋白质；b)将序列表中序列3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且具有相同功能的蛋白质。
【技术特征摘要】
1.蛋白质，是如下a)或b)的蛋白质：a)氨基酸序列是序列表中序列3的蛋白质；b)将序列表中序列3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且具有相同功能的蛋白质。2.与权利要求1所述蛋白质相关的生物材料，为下述B1)-B5)中的任一种：B1)编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子；B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体或含有B2)所述表达盒的重组载体；B4)含有B1)所述核酸分子的重组菌或含有B2)所述表达盒的重组菌或含有B3)所述重组载体的重组菌；B5)含有B1)所述核酸分子的细胞系或含有B2)所述表达盒的细胞系或含有B3)所述重组载体的细胞系。3.根据权利要求2所述的相关生物材料，其特征在于：B1)所述核酸分子为如下1)或2)或3)的DNA分子：1)其核苷酸序列是序列表中序列1所示的cDNA分子或序列2所示的DNA分子；2)与1)限定的...
【专利技术属性】
技术研发人员：周明，许勇，张洁，张海英，郭绍贵，李常保，
申请(专利权)人：北京市农林科学院，
类型：发明
国别省市：北京;11
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