本发明专利技术提供了一种用于检测HLA‑DP基因rs3077位点多态性的质粒标准品，其制备方法包括以下步骤：(1)设计HLA‑DP基因rs3077位点的引物，正、反向引物序列分别为：5′‑AATAACTGTGTGTGTTGCTG‑3′和5′‑TCAATATCCTCAGACCTTTC‑3′；(2)筛选HLA‑DP基因rs3077位点CC基因型和TT基因型的EDTA抗凝外周血标本；(3)构建含HLA‑DP基因rs3077位点三种不同基因型目的片段的质粒标准品。该标准品具有纯度高、成本低、易于保存、准确度高、特异性和稳定性好、可减少实验误差等优点，可长期用于HLA‑DP基因rs3077位点多态性检测。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，具体涉及一种用于检测HLA-DP基因rs3077位点多态性的质粒标准品及其制备方法。
技术介绍
宫颈癌已被列为威胁女性生命的第二大恶性肿瘤，发病率仅次于乳腺癌，每年全球范围内新发病例约五十万。宫颈癌的发生是一个多因素多阶段的复杂过程，近年来很多研究表明HLA基因多态性与宫颈癌的遗传易感性密切相关。人白细胞抗原(Human Leukocyte Anti-gen，HLA)作为机体的适应性免疫核心分子，在HPV感染后的清除和宫颈癌的发生发展过程中具有重要作用。HLA基因分为3类：HLA-I类基因区、HLA-II类基因区和HLA-III类基因区。HLA-II类基因区靠近染色体着丝点，主要包括DR、DQ和DP三个亚区。正常的宫颈上皮细胞不表达HLA-II类基因，当其发生癌变时HLA-II类基因可在肿瘤组织中表达，低分化上皮细胞癌变时仅表达HLA-DP、高分化上皮细胞癌变时除表达HLA-DP外，还可表达少量HLA-DQ。大量研究发现，HLA-DP基因与宫颈癌易感性密切相关，国外研究者Ivansson等发现，HLA-DPBl为瑞典妇女宫颈癌发生的危险因素，国内研究者对关于HLA-DP基因多态性与宫颈癌易感性关系的研究发现，HLA-DP基因上的rs3077位点的突变基因型能够显著增加宫颈癌的发病风险，可以作为中国女性宫颈癌潜在的遗传易感标志物。因此，在检测HLA-DP基因rs3077位点的多态性时，为了获取准确、可靠的检测结果，构建HLA-DP基因rs3077位点的质粒标准品非常必要。但到目前为止未发现有HLA-DP基因rs3077位点的质粒标准品。
技术实现思路
针对于现有技术中存在的上述问题，本专利技术提供一种用于检测HLA-DP基因rs3077位点多态性的质粒标准品及其制备方法，可有效解决该位点阳性标准品缺乏的问题。为实现上述目的，本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：一种用于检测HLA-DP基因rs3077位点多态性的质粒标准品的制备方法，包括以下步骤：(1)设计引物：以HLA-DP基因rs3077位点的基因序列为模版，用Primer-BLAST设计引物，正、反向引物序列分别为：5′-AATAACTGTGTGTGTTGCTG-3′和5′-TCAATATCCTCAGACCTTTC-3′；(2)HLA-DP基因rs3077位点CC基因型和TT基因型EDTA抗凝外周血标本的筛选：采集健康人EDTA抗凝外周血3mL，提取DNA，然后进行PCR扩增、测序，根据测序结果筛选HLA-DP基因rs3077位点基因型分别为CC和TT的标本；(3)构建分别含HLA-DP基因rs3077位点CC、CT和TT基因型的质粒标准品，具体步骤为：①DNA的提取和目的片段的扩增：提取已筛选出的基因型分别为CC和TT外周血标本的DNA，测定其浓度和纯度，然后以该DNA为模板，进行PCR扩增，获得含rs3077位点CC和TT基因型的目的片段，纯化后备用；②连接和转化：分别将纯化产物与pGM-T Vector在16℃下过夜，连接，分别取10μL连接产物加入50μL DH5a感受态细胞中，冰中放置30min，然后42℃水浴90s，再在冰中放置2-3min，再加入950μL不含Amp的LB液体培养基，37℃，200r/min，振荡培养1h，取100μL培养液涂布于含有Amp的LB琼脂固体培养基上，37℃下倒置培养14-16h；③质粒的鉴定：挑取步骤②中得到的白色单菌落，将其接种于含Amp的LB液体培养基中，于37℃，200r/min，培养16-20h后提取质粒，以该质粒为模板进行PCR扩增，测序鉴定。进一步地，步骤(2)和(3)中PCR反应体系为：Primer STAR Max Premix25μL、Primer F 3μL、Primer R 3μL、DNA模板100-150ng，用ddH2O补足体积至50μL。进一步地，步骤(2)和(3)中PCR扩增程序为98℃预变性2min，98℃变性30s，58℃退火15s，72℃延伸15s，共30个循环，最后72℃延伸5min。进一步地，步骤(3)中连接过程反应体系为：3μL目的片段，1μL pGM-T Vector，1μL 10×T4DNA Ligation Buffer，1μL T4DNA Ligase，4μL ddH2O。进一步地，步骤(3)中含Amp的LB琼脂固体/液体培养基为含100μg/mL Amp、20mg/L X-Gal和100mmol/L IPTG的LB琼脂固体/液体培养基。上述所述制备方法制备得到的质粒标准品。本专利技术提供的一种用于检测HLA-DP基因rs3077位点多态性的质粒标准品及其制备方法，具有以下有益效果：(1)本专利技术设计了与宫颈癌易感性显著相关的HLA-DP基因rs3077位点的引物序列，以正常人EDTA抗凝外周血基因组DNA为模板，进行PCR扩增，将获得的目的基因与载体链接，转入大肠杆菌，成功构建了用于HLA-DP基因rs3077位点多态性检测的质粒标准品。(2)本专利技术成功构建了用于HLA-DP基因rs3077位点多态性检测的质粒标准品，可保证HLA-DP基因rs3077位点多态性检测结果的准确性、可靠性和有效性，为医学检验实验室采用荧光探针法检测rs3077位点多态性和判断该位点与宫颈癌遗传易感性提供了阳性标准品，解决了该位点阳性标准品缺乏问题。(3)该标准品具有纯度高、成本低、易于保存、准确度高、特异性和稳定性好、可减少实验误差等优点，可长期用于HLA-DP基因rs3077位点多态性检测。附图说明图1为rs3077位点目的片段的琼脂糖凝胶电泳图；图2为转化平板图，其中白色菌落为转化成功的菌落；图3为提取出的质粒的琼脂糖凝胶电泳图；图4为验证过程中质粒的琼脂糖凝胶电泳图；图5为野生型质粒测序结果图；图6为纯合突变型质粒PCR测序结果图；图7野生型质粒DNAMAN比对结果图；图8突变型质粒DNAMAN比对结果图；图9为杂合突变型质粒PCR测序结果图；图10为CC基因型质粒标准品和待测标本的荧光探针检测结果图；图11为TT基因型质粒标准品和待测标本的荧光探针检测结果图；图12为CT基因型质粒标准品和待测标本的荧光探针检测结果图。具体实施方式实施例1设计扩增rs3077位点的引物在NCBI数据库中查找SNP rs3077的基因序列，该位点碱基野生型为C，突变型为T，SNP位点附近基因序列为：TCTTCTCACTTCATGTGAAAACTAC[C/T]CCAGTGGCTGACTGAATTGCTGACC，全部序列见SEQ ID NO：1，以rs3077基因序列为模板，用Primer-BLAST设计引物，目的片段大小为506bp，包含了待检测的野生型或突变型位点，即序 列中的Y位点，筛选出特异性较好的引物，正、反向引物序列分别为：5′-AATAACTGTGTGTGTTGCTG-3′和5′-TCAATATCCTCAGACCTTTC-3′，序列分别见SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3，然后送英潍捷基(上海)贸易有限公司合成引物，合成的引物干粉用无菌去离子水稀释成5pmol/μL，备用；以10个DNA样品为模板，进行PCR扩增，反本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于检测HLA‑DP基因rs3077位点多态性的质粒标准品的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)设计引物：以HLA‑DP基因rs3077位点的基因序列为模版，用Primer‑BLAST设计引物，正、反向引物序列分别为：5′‑AATAACTGTGTGTGTTGCTG‑3′和5′‑TCAATATCCTCAGACCTTTC‑3′；(2)HLA‑DP基因rs3077位点CC基因型和TT基因型EDTA抗凝外周血标本的筛选：采集健康人EDTA抗凝外周血3mL，提取DNA，然后进行PCR扩增、测序，根据测序结果筛选HLA‑DP基因rs3077位点基因型分别为CC和TT的标本；(3)构建分别含HLA‑DP基因rs3077位点CC、CT和TT基因型的质粒标准品，具体步骤为：①DNA的提取和目的片段的扩增：提取已筛选出的基因型分别为CC和TT外周血标本的DNA，测定其浓度和纯度，然后以该DNA为模板，进行PCR扩增，获得含rs3077位点CC和TT基因型的目的片段，纯化后备用；②连接和转化：分别将纯化产物与pGM‑T Vector在16℃下过夜，连接，分别取10μL连接产物加入50μL DH5a感受态细胞中，冰中放置30min，然后42℃水浴90s，再在冰中放置2‑3min，再加入950μL不含Amp的LB液体培养基，37℃，200r/min，振荡培养1h，取100μL培养液涂布于含有Amp的LB琼脂固体培养基上，37℃下倒置培养14‑16h；③质粒的鉴定：挑取步骤②中得到的白色单菌落，将其接种于含Amp的LB液体培养基中，于37℃，200r/min，培养16‑20h后提取质粒，以该质粒为模板进行PCR扩增，测序鉴定。...
【技术特征摘要】
1.一种用于检测HLA-DP基因rs3077位点多态性的质粒标准品的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)设计引物：以HLA-DP基因rs3077位点的基因序列为模版，用Primer-BLAST设计引物，正、反向引物序列分别为：5′-AATAACTGTGTGTGTTGCTG-3′和5′-TCAATATCCTCAGACCTTTC-3′；(2)HLA-DP基因rs3077位点CC基因型和TT基因型EDTA抗凝外周血标本的筛选：采集健康人EDTA抗凝外周血3mL，提取DNA，然后进行PCR扩增、测序，根据测序结果筛选HLA-DP基因rs3077位点基因型分别为CC和TT的标本；(3)构建分别含HLA-DP基因rs3077位点CC、CT和TT基因型的质粒标准品，具体步骤为：①DNA的提取和目的片段的扩增：提取已筛选出的基因型分别为CC和TT外周血标本的DNA，测定其浓度和纯度，然后以该DNA为模板，进行PCR扩增，获得含rs3077位点CC和TT基因型的目的片段，纯化后备用；②连接和转化：分别将纯化产物与pGM-T Vector在16℃下过夜，连接，分别取10μL连接产物加入50μL DH5a感受态细胞中，冰中放置30min，然后42℃水浴90s，再在冰中放置2-3min，再加入950μL不含Amp的LB液体培养基，37℃，200r/min，振荡培养1h，取100μL培养液涂布于含有Amp的LB琼脂固体培养基上，37℃下倒置培养14-16h；③质粒的鉴定：挑取步骤②中得到的白色单菌落，将其接种于含Amp的LB液体...
【专利技术属性】
技术研发人员：李晓瑞，张蓉，邓银，林秀芳，刘月，
申请(专利权)人：成都中创清科医学检验所有限公司，
类型：发明
国别省市：四川;51
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