一种基于DNA条形码技术快速鉴定茶叶品种的方法，属于茶叶质量安全领域，用改良的植物DNA提取试剂盒提取样品总DNA，再对特定序列进行PCR扩增、纯化、测序，建立闽南乌龙茶的基因库，将未知品种的闽南乌龙茶的DNA序列与所建的基因库进行同源性分析，可快速鉴定待测闽南乌龙茶品种。经改良的植物DNA提取试剂盒提取的茶叶样品DNA浓度高，电泳条带清晰；该方法能快速、准确地鉴定出闽南乌龙茶产品的品种，避免人工感官审评主观意识的影响和传统化学检测方法的繁杂操作，结果科学准确。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及利用DNA条形码技术快速鉴定闽南乌龙茶品种的方法，属于茶叶质量安全领域。
技术介绍
乌龙茶是我国的六大茶类之一，一直以来以独特的滋味和香气受到大众的喜爱，目前，市售闽南乌龙茶的所制品种主要有铁观音、黄旦、本山、毛蟹等，虽然这几个品种都是国家级的茶树优良品种，品质优良，但铁观音品种制成的闽南乌龙茶由于具有独特的“观音韵”，因而价格较其他品种制成的闽南乌龙茶价格高。近年来闽南乌龙茶以次充好的现象普遍，消费者通常无法辨别，因此，通过技术手段来明确鉴定闽南乌龙茶品种、建立规范的乌龙茶产品质量标准逐渐成为茶叶研究的重点和热点。成品茶是茶叶的实际应用形式，因此以市售乌龙茶为研究对象，进行分子鉴定进而鉴别其品种，对提高我国成品茶品种鉴定技术具有一定的现实意义。
技术实现思路
本专利技术在于提供一种利用DNA条形码技术鉴定闽南乌龙茶品种的方法，通过该方法可快速、准确地鉴定闽南乌龙茶产品的品种，有利于规范闽南乌龙茶市场。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种用于鉴定闽南乌龙茶品种方法的引物，所述的引物为：3F：5’-CGTACAGTACTTTTGTGTTTACGAG-3’；1R：5’-ACCCAGTCCATCTGGAAATCTTGGTTC-3’。一种利用DNA条形码技术对闽南乌龙茶进行品种鉴定的方法，包含以下几个步骤：（1）茶样的准备：收集不同茶树品种的制成的闽南乌龙茶茶叶样品；（2）茶叶样品DNA的提取：试剂盒提取植物DNA的步骤为：①取植物组织在研钵中加入液氮充分研磨成细粉；研磨前准备一个1.5mL的离心管，加入400μl缓冲液AP1和4μl RNase室温备用；②转移细粉20-30mg到1.5mL离心管漩涡振荡，充分混匀帮助裂解；③65℃水浴10min，在水浴过程中颠倒离心管2-3次，混合样品；④加入130μl缓冲液AP2，充分混匀，冰上放置5分钟，14000rpm离心5-10min，小心吸取上清液到一个新的1.5mL离心管中；⑤计算上清量加入1.5倍体积的AP3/E，立即吹打混匀；⑥将上一步所得的混合物加入一个吸附柱AC中，吸附柱放入收集管中13000rmp离心30-60秒，倒掉收集管中的废液；⑦加入600μl漂洗液WB，12000rmp离心30秒，弃掉废液；⑧加入600μl漂洗液WB，12000rmp离心30秒，弃掉废液；⑨将吸附柱AC放回空收集管中，13000rmp离心2分钟，去除漂洗液；⑩取出吸附柱AC放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加100μl洗脱缓冲液EB，室温放置3-5min，12000rmp离心1min，将得到的溶液重新加入吸附柱中，室温放置2min，12000rmp离心1min；所得的DNA可存放于2-8℃，若要长时间保存可放置于-20℃；（3）特定基因序列的PCR扩增、纯化：matK序列扩增选用所述引物3F(5’-CGT-ACA-GTA-CTT-TTG-TGT-TTA-CGA-G-3’)和1R（5’-ACC-CAG-TCC-ATC-TGG-AAA-TCT-TGG-TTC-3’) ，PCR扩增总体积为20μL，反应体系为PCR mix 10μL，引物各1μL，茶叶样品总DNA 1μL，ddH2O 7μL；PCR反应程序为95℃预变性30s；56℃30s，72℃30s，10个循环；88℃30s，56℃30s，72℃30s，25个循环；72℃10min；纯化PCR产物后送至铂尚生物公司测序；（4）序列分析：序列用HMMer注释法切除5.8和26S端，保留特定序列的全长；经BLAST比对，进行同源性分析。步骤（1）中选取不同品种的闽南乌龙茶产品作为实验对象。步骤（2）中，①②③替换为：取20-30mg的茶叶样品，用液氮速冻，在液氮中研磨至粉末，加入已加600μL AP1缓冲液和6-8μg蛋白酶K的1.5mL离心管中，在42℃恒温水浴锅中水浴15h。步骤（3）对所提取样品的DNA进行PCR扩增，获得高纯度的matK片段。本专利技术的优点在于：使用改良的植物DNA提取试剂盒，成功提取出一定浓度的样品DNA，电泳条带清晰，克服了原试剂盒和常用植物DNA提取方法提取样本DNA浓度低、无电泳条带的情况；将DNA条形码技术应用于闽南乌龙茶产品的品种鉴定，极大程度减少了感官审评的造成的误差，提高产品品种的鉴定效率，有利于闽南乌龙产品市场的规范。附图说明图1不同闽南乌龙茶产品的总DNA电泳图，从左至右分别为铁观音A、铁观音B、铁观音C、Maker、Maker、金观音、本山、铁观音D、黄金桂、Maker。图2 不同品种的matK序列的PCR产物电泳图，从右至左分别为DNA maker、铁观音、铁观音、本山、本山、黄旦、黄旦、大叶乌龙、大叶乌龙、福建水仙、金观音、毛蟹、佛手。具体实施方式实施例1（1）茶样的准备：所选样品为福建省主要闽南乌龙茶产地不同茶树品种制成的闽南乌龙茶茶叶样品，详细信息见表1。表1样品信息表（2）上述茶叶样品DNA的提取：提取方法主要是对艾德来生物公司的新型植物基因组DNA快速提取试剂盒进行改良。试剂盒提取植物DNA的步骤为：①取适量植物组织在研钵中加入液氮充分研磨成细粉；研磨前准备一个1.5mL的离心管，加入400μl缓冲液AP1和4μlRNase室温备用；②转移细粉20-30mg到前面准备的1.5mL离心管漩涡振荡，充分混匀帮助裂解；③65℃水浴10min，在水浴过程中颠倒离心管3次，混合样品；④加入130μl缓冲液AP2，充分混匀，冰上放置5分钟，14000rpm离心5-10min，小心吸取上清液到一个新的1.5mL离心管中；⑤计算上清量加入1.5倍体积的AP3/E，立即吹打混匀；⑥将上一步所得的混合物加入一个吸附柱AC中，（吸附柱放入收集管中）13000rmp离心50秒，倒掉收集管中的废液；⑦加入600μl漂洗液WB，12000rmp离心30秒，弃掉废液；⑧加入600μl漂洗液WB，12000rmp离心30秒，弃掉废液；⑨将吸附柱AC放回空收集管中，13000rmp离心2分钟，尽量去除漂洗液；⑩取出吸附柱AC放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加100μl洗脱缓冲液EB，室温放置4min，12000rmp离心1min，将得到的溶液重新加入吸附柱中，室温放置2min，12000rmp离心1min。所得的DNA可存放于2-8℃，若要长时间保存可放置于-20℃。改良的步骤为：取20-30mg的茶叶样品，用液氮速冻，在液氮中研磨至粉末，加入已加600μl AP1缓冲液和6-8μg蛋白酶K的1.5mL离心管中，在42℃恒温水浴锅中水浴15h，后续步骤参照艾德来生物公司的新型植物基因组DNA快速提取试剂盒的说明书中的步骤④-⑩，最后加入3μlRNase在37℃水浴锅中水浴30min。茶叶样品DNA的提取：提取方法主要是对艾德来生物公司的新型植物基因组DNA快速提取试剂盒进行改良。先取20-30mg的茶叶样品，用液氮速冻，在液氮中研磨至粉末，加入已加600μl AP1缓冲液和6-8μg蛋白酶K的1.5mL离心管中，在42℃恒温水浴锅中水浴15h，后续步骤参照艾德来生物公司的新型植物基因组DNA快速提取试剂盒的说明书。（3）特定基因序列的PCR扩增、纯化：matK序列本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于鉴定闽南乌龙茶品种方法的引物，其特征在于：所述的引物为：3F：5’‑CGTACAGTACTTTTGTGTTTACGAG‑3’；1R：5’‑ACCCAGTCCATCTGGAAATCTTGGTTC‑3’。
【技术特征摘要】
1.一种用于鉴定闽南乌龙茶品种方法的引物，其特征在于：所述的引物为：3F：5’-CGTACAGTACTTTTGTGTTTACGAG-3’；1R：5’-ACCCAGTCCATCTGGAAATCTTGGTTC-3’。2.一种基于DNA条形码技术的闽南乌龙茶品种鉴定方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：（1）茶样的准备：收集不同茶树品种的制成的闽南乌龙茶茶叶样品；（2）茶叶样品DNA的提取：试剂盒提取植物DNA的步骤为：①取植物组织在研钵中加入液氮充分研磨成细粉；研磨前准备一个1.5mL的离心管，加入400μl缓冲液AP1和4μl RNase室温备用；②转移细粉20-30mg到1.5mL离心管漩涡振荡，充分混匀帮助裂解；③65℃水浴10min，在水浴过程中颠倒离心管2-3次，混合样品；④加入130μl缓冲液AP2，充分混匀，冰上放置5分钟，14000rpm离心5-10min，小心吸取上清液到一个新的1.5mL离心管中；⑤计算上清量加入1.5倍体积的AP3/E，立即吹打混匀；⑥将上一步所得的混合物加入一个吸附柱AC中，吸附柱放入收集管中13000rmp离心30-60秒，倒掉收集管中的废液；⑦加入600μl漂洗液WB，12000rmp离心30秒，弃掉废液；⑧加入600μl漂洗液WB，12000rmp离心30秒，弃掉废液；⑨将吸附柱AC放回空收集管中，13000rmp离心2分钟，去除漂洗液；⑩取出吸附柱AC放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加100μl洗脱缓冲液EB，室温放置3-5min，12000rmp离心1min，将得到的溶液重新加入吸附柱中，室温放置2min，12000rmp...
【专利技术属性】
技术研发人员：孙威江，郭义红，陈志丹，
申请(专利权)人：福建农林大学，
类型：发明
国别省市：福建;35
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