一种血清胆固醇氧化物的检测方法技术

本发明专利技术提供一种血清中胆固醇氧化物的检测方法，所述方法包括：样品处理、皂化、固相萃取、硅烷化衍生、HPLC‑MS/MS分析。所述方法能够同时对血清中胆固醇体内自氧化的代表性产物分别进行定量检测，具有良好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物标记物分析检测
，具体涉及一种血清中胆固醇氧化物的检测方法。
技术介绍
胆固醇对维持人体正常的生理功能有重要的意义，但过多胆固醇在体内堆积又会影响人体自身的健康。大量研究已表明：心血管疾病(CVD)的危险因素与氧化应激增加有关。其中，胆固醇氧化产物COPs是机体氧化应激状态的非常特殊的标志物之一。在1966年，Brooks等首次在人动脉粥样硬化组织中检测到有被氧化的胆固醇，26-羟胆固醇与7-酮基胆固醇。不过，人们一直认为动脉粥样硬化的重要风险因子是高胆固醇血症，所以多年来一直把注意力集中在高胆固醇血症上，对氧化型胆固醇并未引起重视少有报道。近年来，随着对低密度脂蛋白(LDL)的深入研究，研究首次发现，心血管最严重的风险因子之一可能是被氧化的胆固醇，即胆固醇氧化物(cholesterol oxidation products)，这类化合物比未经氧化的胆固醇更易导致动脉粥样硬化,增加心脏病和中风发作的风险。胆固醇氧化物在很多方面显示其毒害作用，例如可以增大致癌的可能性，毒害细胞，促使细胞发生突变，使固醇类化合物代谢紊乱，可明显对动脉粥样硬化起作用，危害人体健康。目前，已经有多种食品中的胆固醇氧化物被研究，包括蛋制品、动物脂肪
等。科研结果显示出，胆固醇及其氧化产物在某种程度上是心血管疾病的风险因子，不过胆固醇氧化物与心血管疾病发生潜在机制的研究并不明确。胆固醇在体外的光照、加热等环境条件下引起A环、B环或支链的一系列自氧化反应，因而产生多种氧化产物。胆固醇在体内也可以通过自氧化方式产生。理论上，胆固醇氧化物可有70余种，其中一些不是胆固醇体内自氧化的代表性产物，而其他一些胆固醇氧化物是胆固醇体内自氧化的代表性产物，可内源性产生或从饮食中获得。
技术实现思路
针对现有技术中不重视血清中胆固醇氧化物的检测、胆固醇易体外自氧化形成胆固醇氧化物、无法对体内自氧化产生的胆固醇氧化物进行分类检测、处理过程中氧固醇损失导致难以精准定量、血清成分复杂干扰多等缺陷，本专利技术提供一种血清胆固醇氧化物的检测方法。具体而言，本申请提供一种血清胆固醇氧化物的检测方法，其特征在于包括以下步骤：(1)样品处理：用氯仿-甲醇萃取血清(2)皂化：用KOH溶液、无水乙醇、BHT常温震荡皂化；(3)固相萃取：皂化后的溶液过SPE固相萃取柱；(4)衍生化：将步骤(3)的产物以Tri-Sil试剂进行衍生；(5)液质联用分析：液相色谱采用RP-18e阳离子柱，质谱采用API4000三重四极质谱仪。本专利技术所述血清胆固醇氧化物的检测方法，其特征在于所述步骤(1)样品处理包括：萃取前先向血清中加入定量内标的步骤，所述的定量内标为非体内自氧化产生的胆固醇氧化物种类，例如19-羟胆固醇等。本专利技术所述血清胆固醇氧化物的检测方法，其特征在于所述步骤(1)包括按1:2的体积比配置氯仿-甲醇混合物，将血清用所述氯仿-甲醇混合液稀释10倍，涡旋震荡1min，静置萃取3min，4000g离心10min，吸取氯仿层。本专利技术所述血清胆固醇氧化物的检测方法，其特征在于所述步骤(2)皂化包括：加入60％(w/v)的KOH溶液、无水乙醇、BHT常温震荡皂化24h，其中KOH溶液和无水乙醇的加入量均为血清体积的10倍，BHT的终浓度为5-50ng/mL。本专利技术所述血清胆固醇氧化物的检测方法，其特征在于所述步骤(3)固相萃取包括：将皂化后的溶液用乙醚提取3次，再用蒸馏水洗涤2次，无水硫酸钠干燥后30℃旋蒸除去残留的乙醚；加入血清体积5倍的正己烷溶解后，过SPE固相萃取柱，经过正己烷：二乙醚(95:5，v/v)、正己烷：二乙醚(90:10，v/v)、二乙醚(80:20，v/v)洗涤后，用丙酮：甲醇(60:20v/v)洗脱。本专利技术所述血清胆固醇氧化物的检测方法，其特征在于所述步骤(4)衍生化包括：取皂化后的溶液1ml，氮气吹干，加入400μLTri-Sil试剂，60℃保温45min，旋蒸干燥后加入甲醇：水(3:1，v/v)的溶液中。本专利技术所述血清胆固醇氧化物的检测方法，其特征在于所述步骤(5)液质联用分析中HPLC参数如下：溶液A为甲醇：水(3:1，v/v)，溶液B为异丙醇；0-0.5min 60％的溶液A、40％的溶液B；0.5-3.5min线性洗脱，溶液B由40％提高到70％；>3.5min，100％的溶液B；流速为1ml/min。本专利技术所述血清胆固醇氧化物的检测方法，其特征在于所述步骤(5)液质联用分析中质谱参数为：源温度500、雾化电流3μA、气帘气压25psi、雾化气压25psi。本专利技术所述血清胆固醇氧化物的检测方法，其特征在于所述血清胆固醇氧
化物选自由7α-OH胆固醇、7β-OH胆固醇、5β,6β-环氧胆固醇、5α，6α-环氧胆固醇、7酮基胆固醇、25-OH胆固醇组成的组分。本专利技术所述检测方法达到的有益效果如下：(1)通过样品处理、皂化、固相萃取，分离出血清中胆固醇类组分；通过衍生化使结构相似的胆固醇氧化物更适应后续的HPLC-MS/MS检测，避免了血清中复杂成分的干扰、提高了检测精度。(2)通过加入体内不存在的胆固醇氧化物作为定量内标，其与体内胆固醇氧化物理化性状、化学结构相似，在各处理步骤中的损失相似，以其作为内标能够获得所述体外处理步骤中损失的胆固醇氧化物比例，从而对测得的胆固醇氧化物含量进行校对，提高血清胆固醇氧化物定量的准确度。(3)本专利技术所述方法一次检测即能够同时对血清中胆固醇体内自氧化的代表性产物，7α-OH胆固醇、7β-OH胆固醇、5β,6β-环氧胆固醇、5α，6α-环氧胆固醇、7酮基胆固醇、25-OH胆固醇分别进行定量检测。附图说明图1是胆固醇氧化物HPLC-MS/MS图谱。其中：1：7α-OH胆固醇、2：7β-OH胆固醇、3：7-酮基胆固醇、4：5β,6β-环氧胆固醇、5：5α，6α-环氧胆固醇、6：胆固醇、7：19-OH胆固醇、8：25-OH胆固醇。具体实施方式实施例1：胆固醇氧化物的提取1.取血库中正常个体，待检血清1mL，向其中加入19-OH胆固醇至终浓度10μg/mL，加入10mL氯仿-甲醇混合物(氯仿：甲醇＝1:2，v/v)。涡旋震荡1min，室温静置萃取3min，4000g离心10min，吸取氯仿层。2.加入10mL 60％(w/v)的KOH溶液、10mL无水乙醇、0.5μg BHT，室温震荡24h，使血清中的油脂组分皂化，同时防止胆固醇氧化。3.将未皂化有机相用乙醚提取3次，再用蒸馏水洗涤2次，无水硫酸钠干燥后30℃旋蒸除去残留的溶剂。用5mL正己烷溶解，过SPE固相萃取柱，经过正己烷：二乙醚(95:5，v/v)、正己烷：二乙醚(90:10，v/v)、二乙醚(80:20，v/v)洗涤后，用丙酮：甲醇(60:20v/v)洗脱。4.取固相萃取后的溶液1ml，氮气吹干，加入400μLTri-Sil试剂，60℃保温45min，旋蒸干燥后加入甲醇：水(3:1，v/v)的溶液中。实施例2：HPLC-MS/MS分析液相色谱采用RP-18e阳离子柱(50×4.6cm)。275系列自动上样器，275系列高分辨率二元泵。HPLC参数如下：溶液A为甲醇：水(3:1，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种血清胆固醇氧化物的检测方法，其特征在于包括以下步骤：(1)样品处理：用氯仿‑甲醇萃取血清；(2)皂化：用KOH溶液、无水乙醇、BHT常温震荡皂化；(3)固相萃取：皂化后的溶液过SPE固相萃取柱；(4)衍生化：将步骤(3)的产物以Tri‑Sil试剂进行衍生；(5)液质联用分析：液相色谱采用RP‑18e阳离子柱，质谱采用API4000三重四极质谱仪。

【技术特征摘要】
1.一种血清胆固醇氧化物的检测方法，其特征在于包括以下步骤：(1)样品处理：用氯仿-甲醇萃取血清；(2)皂化：用KOH溶液、无水乙醇、BHT常温震荡皂化；(3)固相萃取：皂化后的溶液过SPE固相萃取柱；(4)衍生化：将步骤(3)的产物以Tri-Sil试剂进行衍生；(5)液质联用分析：液相色谱采用RP-18e阳离子柱，质谱采用API4000三重四极质谱仪。2.如权利要求1所述血清胆固醇氧化物的检测方法，其特征在于所述步骤(1)样品处理包括：萃取前先向血清中加入定量内标的步骤，所述的定量内标为非体内自氧化产生的胆固醇氧化物种类。3.如权利要求2所述的血清胆固醇氧化物的检测方法，其特征在于所述定量内标为19-OH胆固醇。4.如权利要求1所述血清胆固醇氧化物的检测方法，其特征在于所述步骤(1)包括按1:2的体积比配置氯仿-甲醇混合物，将血清用所述氯仿-甲醇混合液稀释10倍，涡旋震荡1min，静置萃取3min，4000g离心10min，吸取氯仿层。5.如权利要求1所述血清胆固醇氧化物的检测方法，其特征在于所述步骤(2)皂化包括：加入60％(w/v)的KOH溶液、无水乙醇、BHT常温震荡皂化24h，其中KOH溶液和无水乙醇的加入量均为血清体积的10倍，BHT的终浓度为5-50ng/mL。6.如权利要求1所述血清胆固醇氧化物的检测方法，其特征在于所述步骤(3)固相萃取包括：将皂化后的溶液用乙醚提取3次，再用蒸馏水洗涤...

【专利技术属性】
技术研发人员：韩晓菲，
申请(专利权)人：大连大学，
类型：发明
国别省市：辽宁;21