一种从西兰花中提取萝卜硫素的制备方法技术

本发明专利技术涉及一种从西兰花中提取萝卜硫素的制备方法，属于萝卜硫素领域。本发明专利技术首先通过对大肠杆菌进行变异处理，得到产硫代葡萄糖苷酶的大肠杆菌，再将变异大肠杆菌进行培养，然后对西兰花进行处理、超声提取，得到提取液，然后再通过酶解、加入氢氧化钠、正己烷等除去油脂、金属离子、蛋白质等杂质，得到葡萄糖萝卜硫素苷溶液，再将大肠杆菌进行发酵，向发酵液中加入葡萄糖萝卜硫素苷反应，再分别经过离心分离、CO2超临界萃取、常压蒸馏、低温真空冻干，得到萝卜硫素。本发明专利技术制备的萝卜硫素产率高，纯度高，可应用于大规模生产中，并且生产时间较常规方法减少了6～8h，纯度达到了95%以上。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种从西兰花中提取萝卜硫素的制备方法，属于萝卜硫素领域。
技术介绍
萝卜硫素（Sulforaphane）又称“莱菔硫烷”，是葡萄糖萝卜硫苷经黑芥子酶酶解或酸水解后产生的。它是迄今为止蔬菜中发现的最强的抗癌活性物。萝卜硫素就其化学成分而言，为异硫氰酸酯类化合物，易溶于水，相对分子质量177.3，分子式C6H11S2NO，它是一种多功能诱导物，可诱导机体产生Ⅱ型解毒酶—谷胱甘肽转移酶和醌还原酶，此酶可对许多致癌物产生抗体，从而起到抗癌作用。另外，萝卜硫素还具有抑制DNA去酰化酶的能力。近年来，随着癌症的发病率的逐渐上升，萝卜硫素作为一种具有较强的抗癌作用的植物活性物质，有着广阔的研究价值及市场前景。目前制备萝卜硫素的方法有：1.以干燥西兰花种子粉加水水解，获得固液混合物；再向该混合物中加入无水乙醇，进行超声浸提、抽滤或双层纱布过滤，获得滤液；接着对滤液进行真空浓缩，蒸发乙醇并获得浓缩液；浓缩液进行大孔树脂层析及用乙醇水溶液进行梯度洗脱，获得含萝卜硫素洗脱液并继续进行氧化铝柱层析、浓缩，获得萝卜硫素浸膏粗品；最后将获得的粗品加水溶解后用极性溶剂萃取，收集有机层并真空浓缩获得油状浸膏，即高纯萝卜硫素。该方法存在的主要问题是：未对种子进行洗脱，由于油脂的阻挡，西兰花种子中的硫代葡萄糖苷和硫代葡萄糖苷酶难以有效接触，导致萝卜硫代的生成率低； 未对水解液进行pH、温度条件的控制，硫代葡萄糖苷酶对硫代葡萄糖苷的水解处于非优化环境，致使大量杂质生成，分离纯化困难且成本高；用乙酸乙酯萃取的选择度低，不仅可萃取萝卜硫素，还可萃取其他类似物，且在较高温度下真空浓缩，萝卜硫素不稳定，易重排生成多种异构体，产品纯度低；无水乙醇回收率低，生产成本高，缺乏竞争力。2.将新鲜西兰花的食用部分花枝脱水后烘至恒重并粉碎，获得西兰花干粉；将新获得的介子粉碎提取，再真空抽滤除杂，得到粗酶液；向所述西兰花干粉中加入所述粗酶液，搅拌均匀，经酶解、超声波振荡提取并过筛及真空抽滤除渣、真空浓缩后获得萝卜硫素粗提水溶液；向萝卜硫素粗提水溶液中加入乙酸乙酯萃取、收集乙酸乙酯相并真空浓缩成膏状萝卜硫素粗提物；将膏状萝卜硫素粗提物经冷冻干燥至恒重，即得纯度为1%～15%的萝卜硫素粗品。该方法存在的主要问题有：新鲜西兰花食用部分含水量高达90%左右，进行干燥耗能极高且在高温环境下萝卜硫素快速分解；新鲜芥子受季节控制，难以常年生产且粗酶液中杂质和杂酶均多，水解生成的杂质多，萝卜硫素生成率低；因为萝卜硫素在水溶液中的稳定时间仅约90min，而水解时间长达8小时，在此期间萝卜硫素大量重排或异构化，导致萝卜硫素生成率极低。由此可知，目前萝卜硫素生产存在着生成率极低、生产时间长、能耗高、产品纯度低、产品成本高等共同缺陷，有必要进一步研发新方法，提升萝卜硫素生成率和纯度、降低生产成本。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题：针对目前萝卜硫素生产中存在的因生产高温加热时间长，萝卜硫素大量发生重排或异构化，导致萝卜硫素生成率极低，并且产品纯度低的问题，本专利技术首先通过对大肠杆菌进行变异处理，得到产硫代葡萄糖苷酶的大肠杆菌，再将变异大肠杆菌进行培养，然后对西兰花进行处理、超声提取，得到提取液，然后再通过酶解、加入氢氧化钠、正己烷等除去油脂、金属离子、蛋白质等杂质，得到葡萄糖萝卜硫素苷溶液，再将大肠杆菌进行发酵，向发酵液中加入葡萄糖萝卜硫素苷反应，再分别经过离心分离、CO2超临界萃取、常压蒸馏、低温真空冻干，得到萝卜硫素。本专利技术制备的萝卜硫素产率高，纯度高，可应用于大规模生产中，并且生产时间较常规方法减少了6～8h，纯度达到了95%以上。为解决上述技术问题，本专利技术采用如下所述的技术方案是：（1）称取3～5g牛肉膏、10～15g蛋白胨、5～7g氯化钠加入到培养皿中，再加入700～800mL去离子水，搅拌10～20min，制成培养基，培养菌种；（2）选取10～20株大肠杆菌，用波长为280nm紫外线照射1～2h，选取其中的变异大肠杆菌接种到培养基上，再将培养基置于摇床中，在38～40℃下，振荡培养12～14h，将培养液放入5000～6000r/min离心机中离心分离10～20min，弃去上清液，得到变异大肠杆菌菌种，备用；（3）称取100～200g西兰花，置于80～90℃烘箱内干燥30～40min，再将干燥后的西兰花用粉碎机粉碎，得到干西兰花粉末，将西兰花粉末加入到烧杯中，向烧杯中加入200～300mL去离子水，并置于3000～3200W超声波萃取机上，控制温度在60～70℃，超声提取30～40min，过滤，得到提取液；（4）将上述提取液置于酶解罐中，同时向酶解罐中依次加入300～400mL去离子水、50～100mLpH为7.1～7.3磷酸盐缓冲溶液，搅拌30～40min，再向酶解罐中依次加入0.3～0.5g果胶酶、0.8～1.0g纤维素酶、1～3g半纤维素酶，控制酶解罐内温度为45～55℃，搅拌反应70～90min，反应结束，得到西兰花酶解液；（5）将上述西兰花酶解液放入5000～6000r/min离心机中离心分离10～20min，弃去下层杂质，得到西兰花酶解上清液，向上清液中依次加入50～70mL0.5mol/L氢氧化钠溶液、1～3g氯化锌，搅拌5～10min，过滤，得到滤液，向滤液中加入100～200mL正己烷，搅拌10～20min，静置，分液，得到水相，即葡萄糖萝卜硫素苷溶液；（6）向发酵罐中依次加入20%步骤（2）备用的变异大肠杆菌菌种、10～20g蛋白胨、3～5g酵母膏、100～200mLpH为7.2～7.4磷酸盐缓冲液、300～400mL去离子水，控制温度在30～40℃下，搅拌发酵10～12h，向发酵液中加入上述葡萄糖萝卜硫素苷溶液，保温搅拌反应40～60min，再将反应液离心分离10～20min，弃去下层杂质，得到萝卜硫素混合液；（7）将上述萝卜硫素混合液加入到CO2超临界萃取仪中，控制萃取压力为20～30MPa，萃取温度为35～40℃，CO2的流量为25～35kg/h，萃取10～20min，得到萝卜硫素溶液，将萝卜硫素溶液常温下减压蒸馏至膏状，再置于-10～-15℃真空冷冻干燥器内，冻干5～6h，得到淡黄色粉末，即萝卜硫素。本专利技术的应用方法：称取3～5g上述制备的从西兰花中提取的萝卜硫素，将其溶解于150～200mL30～40℃温水中，搅拌2～3min后口服，每天服用3～4次，服用5～7天后，发现恶性癌细胞没有发生病变和转移，本专利技术可以有效的预防癌症及抑制癌细胞的转移和病变。本专利技术与其他方法相比，有益技术效果是：（1）本专利技术主要通过酶解、加入氢氧化钠、正己烷等除去油脂、金属离子、蛋白质等杂质，并且通过发酵得到的硫代葡萄糖苷酶无其他杂酶，因此提高了萝卜硫素的其提取率和纯度，提取率达到50％以上，纯度达到了95%以上；（2）本专利技术较常规制备方法生产时间减少了6～8h。具体实施方式首先称取3～5g牛肉膏、10～15g蛋白胨、5～7g氯化钠加入到培养皿中，再加入700～800mL去离子水，搅拌10～20min，制成培养基，培养菌种；选取10～20株大肠杆菌，用波长为280nm紫外线照射1～2h，选取其中的变异大肠杆菌接种到培养基上，再将培养基置本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种从西兰花中提取萝卜硫素的制备方法，其特征在于具体制备步骤为：（1）称取3～5g牛肉膏、10～15g蛋白胨、5～7g氯化钠加入到培养皿中，再加入700～800mL去离子水，搅拌10～20min，制成培养基，培养菌种；（2）选取10～20株大肠杆菌，用波长为280nm紫外线照射1～2h，选取其中的变异大肠杆菌接种到培养基上，再将培养基置于摇床中，在38～40℃下，振荡培养12～14h，将培养液放入5000～6000r/min离心机中离心分离10～20min，弃去上清液，得到变异大肠杆菌菌种，备用；（3）称取100～200g西兰花，置于80～90℃烘箱内干燥30～40min，再将干燥后的西兰花用粉碎机粉碎，得到干西兰花粉末，将西兰花粉末加入到烧杯中，向烧杯中加入200～300mL去离子水，并置于3000～3200W超声波萃取机上，控制温度在60～70℃，超声提取30～40min，过滤，得到提取液；（4）将上述提取液置于酶解罐中，同时向酶解罐中依次加入300～400mL去离子水、50～100mLpH为7.1～7.3磷酸盐缓冲溶液，搅拌30～40min，再向酶解罐中依次加入0.3～0.5g果胶酶、0.8～1.0g纤维素酶、1～3g半纤维素酶，控制酶解罐内温度为45～55℃，搅拌反应70～90min，反应结束，得到西兰花酶解液；（5）将上述西兰花酶解液放入5000～6000r/min离心机中离心分离10～20min，弃去下层杂质，得到西兰花酶解上清液，向上清液中依次加入50～70mL0.5mol/L氢氧化钠溶液、1～3g氯化锌，搅拌5～10min，过滤，得到滤液，向滤液中加入100～200mL正己烷，搅拌10～20min，静置，分液，得到水相，即葡萄糖萝卜硫素苷溶液；（6）向发酵罐中依次加入20%步骤（2）备用的变异大肠杆菌菌种、10～20g蛋白胨、3～5g酵母膏、100～200mLpH为7.2～7.4磷酸盐缓冲液、300～400mL去离子水，控制温度在30～40℃下，搅拌发酵10～12h，向发酵液中加入上述葡萄糖萝卜硫素苷溶液，保温搅拌反应40～60min，再将反应液离心分离10～20min，弃去下层杂质，得到萝卜硫素混合液；（7）将上述萝卜硫素混合液加入到CO2超临界萃取仪中，控制萃取压力为20～30MPa，萃取温度为35～40℃，CO2的流量为25～35kg/h，萃取10～20min，得到萝卜硫素溶液，将萝卜硫素溶液常温下减压蒸馏至膏状，再置于‑10～‑15℃真空冷冻干燥器内，冻干1～2h，得到淡黄色粉末，即萝卜硫素。...

【技术特征摘要】
1.一种从西兰花中提取萝卜硫素的制备方法，其特征在于具体制备步骤为：（1）称取3～5g牛肉膏、10～15g蛋白胨、5～7g氯化钠加入到培养皿中，再加入700～800mL去离子水，搅拌10～20min，制成培养基，培养菌种；（2）选取10～20株大肠杆菌，用波长为280nm紫外线照射1～2h，选取其中的变异大肠杆菌接种到培养基上，再将培养基置于摇床中，在38～40℃下，振荡培养12～14h，将培养液放入5000～6000r/min离心机中离心分离10～20min，弃去上清液，得到变异大肠杆菌菌种，备用；（3）称取100～200g西兰花，置于80～90℃烘箱内干燥30～40min，再将干燥后的西兰花用粉碎机粉碎，得到干西兰花粉末，将西兰花粉末加入到烧杯中，向烧杯中加入200～300mL去离子水，并置于3000～3200W超声波萃取机上，控制温度在60～70℃，超声提取30～40min，过滤，得到提取液；（4）将上述提取液置于酶解罐中，同时向酶解罐中依次加入300～400mL去离子水、50～100mLpH为7.1～7.3磷酸盐缓冲溶液，搅拌30～40min，再向酶解罐中依次加入0.3～0.5g果胶酶、0.8～1.0g纤维素酶、1～3g半纤维素酶，控制酶解罐内温度为45～...

【专利技术属性】
技术研发人员：仇颖莹，孟浩影，
申请(专利权)人：仇颖莹，
类型：发明
国别省市：江苏;32