本发明专利技术埃可病毒1型VP1蛋白特异性抗原表位及其融合蛋白的制备、应用涉及基因工程技术、疫苗和诊断试剂领域。本发明专利技术是通过计算机分析埃可病毒1型表面蛋白VP1氨基酸序列，筛选出含强特异性抗原表位的蛋白片段，即第75位氨基酸至第140位氨基酸，第203位氨基酸至第236位氨基酸，这两个蛋白片段之间通过两个甘氨酸和一个丝氨酸连接，形成一个抗原表位融合蛋白。选择真核和原核生物均偏爱的密码子，化学合成该抗原表位融合蛋白的全新基因序列，利用基因工程技术，表达制备埃可病毒1型VP1蛋白抗原表位融合蛋白，用于埃可病毒抗体检测试剂的研制，及用于埃可病毒单抗和多抗制备。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术埃可病毒1型VP1蛋白特异性抗原表位及其融合蛋白的制备、应用涉及的是筛选出含强抗原表位的埃可病毒1型的表面VP1蛋白片段，利用基因工程技术，制备埃可病毒1型的VP1蛋白抗原表位的融合蛋白。选择真核和原核生物均偏爱的密码子，化学合成全新的VP1蛋白抗原表位融合蛋白的基因序列，利用基因工程技术表达融合蛋白，表达的融合蛋白可用于埃可病毒疫苗及抗体检测试剂的研制等，本专利技术涉及基因工程技术、疫苗和诊断试剂领域。
技术介绍
人肠道致细胞病变孤儿病毒（Enteric Cytopathogenichuman Orphan Virus，ECHO），简称埃可病毒，是一类单股正链RNA的肠道病毒，有34个血清型。最初对其致病性并不清楚，后来证明埃可病毒与无菌脑膜炎、婴儿腹泻、手足口病等多种疾病有关。大量研究和数据分析最终显示，本病遍布世界各地，在人群中引起广泛传播或流行，其感染可引起无菌性脑膜炎、发疹、胃肠道疾病、肝炎和肺炎等多种人类疾病，其中无菌性脑膜炎最为常见，可通过呼吸道和消化道传播。孕妇感染后可通过胎盘传播给胎儿，可引起胎儿畸形甚至死胎。研究调查发现，埃可病毒1型可导致无菌性脑膜炎、麻痹、脑炎、心包炎、心肌炎、皮疹和轻度呼吸道和肠道疾病，也曾在河南病患儿童中引起手足口病，应该受到广泛的关注。埃可病毒VP1与决定血清型的抗原决定因子密切相关，由于VP1区序列分型结果与中和试验鉴定结果具有一致性，而VP1蛋白是病毒中和的主要决定因子，其保守性有利于疫苗开发，也使其作为检测试剂提供可行性和可能性。目前对其全基因序列已经测定，为利用基因工程技术研究诊断试剂、疫苗及筛选抗病毒药物奠定了基础。目前，对埃可病毒的检测方法主要包括平板分离培养法、酶联免疫吸附试验、分子生物学方法。但是，这些方法所需成本较高、需要特定设备、耗时且需要对样品进行复杂的处理，限制其在生活中的广泛应用。建立一种简单、快速、适合现场应用的埃可病毒的检测方法有重要意义。而研制特异的基因重组抗原是建立埃可病毒特异抗体检测试剂的发展方向。
技术实现思路
本专利技术目的是针对上述不足之处提供一种埃可病毒1型VP1蛋白特异性抗原表位及其融合蛋白的制备、应用，本专利技术是筛选出含强抗原表位的埃可病毒1型的表面VP1蛋白片段，利用基因工程技术，制备埃可病毒1型的表面VP1蛋白片段的融合蛋白。通过计算机分析，从埃可病毒1型表面蛋白VP1中筛选出2个含强抗原表位的蛋白片段，分别为第75位氨基酸至第140位氨基酸，第203位氨基酸至第236位氨基酸，选择真核和原核生物均偏爱的密码子，两段蛋白片段之间通过两个甘氨酸和一个丝氨酸连接，构成总长度为103个氨基酸的序列，化学合成全新的基因序列，利用基因工程技术在大肠杆菌BL21（DE3）中表达该基因。表达的蛋白可用于疫苗研制，亦可用于单克隆抗体和多克隆抗体的制备，为埃可病毒检测方法的建立奠定了基础。埃可病毒外层的VP1蛋白，是介导病毒和宿主细胞结合的主要蛋白，同时其又具有较高的保守性，在各型的埃可病毒中变异很小，所以是用作抗原研制埃可病毒抗体检测试剂的理想蛋白。通过计算机分析埃可病毒1型VP1蛋白的氨基酸序列，我们筛选出抗原表位的富集区，选择真核和原核生物均偏爱的密码子优化基因序列，化学合成全新的基因序列，利用基因工程技术表达融合蛋白，表达的融合蛋白具有较好的抗原性和特异性，可用于单克隆抗体和多克隆抗体的制备，组装胶体金试剂条，为埃可病毒快速检测方法的建立奠定基础。埃可病毒1型VP1蛋白特异性抗原表位及其融合蛋白的制备、应用是采取以下步骤实施的：一种埃可病毒1型VP1蛋白抗原表位的融合蛋白，由2段含强特异性抗原表位的VP1蛋白片段组成，2段蛋白片段之间由甘氨酸和丝氨酸连接，整合为全长103个氨基酸的融合蛋白，氨基酸序列如下：。所述的埃可病毒1型VP1蛋白抗原表位的融合蛋白，其中2段含强特异性抗原表位的VP1蛋白片段具体为第75位氨基酸至第140位氨基酸、第203位氨基酸至第236位氨基酸，各段氨基酸序列如下：Seqence1: 第75位aa － 第140位aa：Seqence2:第203位aa － 第236位aa：。所述的埃可病毒1型VP1抗原表位融合蛋白中，2段含强特异性抗原表位的表面VP1蛋白片段，这2段VP1蛋白片段的单个或任意组合的融合蛋白。所述的埃可病毒1型表面蛋白VP1的融合蛋白，通过基因重组技术，利用细菌、酵母细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞及转基因动植物进行重组表达、制备。所述的埃可病毒1型2个VP1蛋白片段的单个或任意组合的融合蛋白用于埃可病毒抗体检测试剂的制备及用于免疫制备抗埃可病毒单抗和多抗制备。埃可病毒1型VP1蛋白特异性抗原表位及其融合蛋白的制备方法如下：1．埃可病毒1型VP1蛋白抗原表位的筛选及其基因片段的化学合成：利用ANTHEWIN、DNAStar等软件，通过计算机分析埃可病毒1型VP1蛋白的全氨基酸序列，筛选出2个含强抗原表位的蛋白片段，分别为第75位氨基酸至第140位氨基酸，第203位氨基酸至第236位氨基酸含有较强的抗原表位。2段蛋白片段之间通过两个甘氨酸和一个丝氨酸连接，构成总长度为103个氨基酸的融合蛋白。选择真核和原核生物均偏爱的密码子，化学合成该融合蛋白的全新基因序列。在合成的基因片段的5'端增加了BamHI的酶切位点（下画线部分），在3'端增加了终止密码子TAA和Xho I酶切位点（下画线部分），使合成的基因片段易于克隆至质粒pGEX-4T-2内的BamHI和Xho I酶切位点内。筛选的埃可病毒1型VP1蛋白内2个含强抗原表位的蛋白片段：Seqence1: 第75位aa － 第140位aa：Seqence2:第203位aa － 第236位aa：2个含强抗原表位蛋白片段连接在一起形成融合蛋白，该融合蛋白的氨基酸序列：化学合成的埃可病毒1型表面蛋白VP1抗原表位融合蛋白的DNA序列（324bp） 2．表达埃可病毒1型VP1抗原表位融合蛋白重组质粒的构建:提取质粒pGEX-4T-2，用 BamHI和Xho I双酶切，电泳后回收酶切的质粒大片段, 溶于去离子水内；同时用BamHI和Xho I双酶切化学合成埃可病毒1型VP1抗原表位融合蛋白的基因片段，电泳回收后, 溶于去离子水内。取等摩尔浓度的上述酶切后DNA片段，在同一离心管内用T4 DNA 连接酶连接，使化学合成埃可病毒1型VP1蛋白基因片段插入到载体pGEX-4T-2内的BamHI和Xho I位点之间，与载体上的起始密码子翻译框架一致，表达一个埃可病毒1型VP1抗原表位融合蛋白。3．重组质粒的筛选与鉴定:将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，涂布含100μg／ml氨苄霉素的LB平板，置37℃ 过夜，次日随机挑取转化菌落和含pGEX-4T-2质粒的对照菌，接种至含4mlLB培养基（含氨苄霉素100μg／ml）的试管内振摇，分别提取质粒,用BamHI和Xho I双酶切验证，1.0%的琼脂糖凝胶电泳结果表明，切下324bp的目的基因片段。同时，将含有外源基因的质粒进行DNA测序分析，测序结果证实重组质粒含有埃可病毒1型表面蛋白VP1基因片段，序列完全正确：构建的重组质粒表达埃可病毒1型VP1抗原表位融合蛋白基因片段（103个氨基酸），在本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种埃可病毒1型VP1蛋白抗原表位的融合蛋白，由2段含强特异性抗原表位的VP1蛋白片段组成，2段蛋白片段之间由甘氨酸和丝氨酸连接，整合为全长103个氨基酸的融合蛋白，氨基酸序列如下：。
【技术特征摘要】
1.一种埃可病毒1型VP1蛋白抗原表位的融合蛋白，由2段含强特异性抗原表位的VP1蛋白片段组成，2段蛋白片段之间由甘氨酸和丝氨酸连接，整合为全长103个氨基酸的融合蛋白，氨基酸序列如下：。2.权利要求1所述的埃可病毒1型VP1抗原表位融合蛋白，其特征在于，所述的埃可病毒1型VP1蛋白抗原表位的融合蛋白，其中2段含强特异性抗原表位的VP1蛋白片段具体为第75位氨基酸至第140位氨基酸和第203位氨基酸至第236位氨基酸，各段氨基酸序列如下：Seqence1: 第75位aa － 第140位aa：Seqence2:第203位aa － 第236位aa：。3.权利要求1所述的埃可病毒1型VP1蛋白抗原表位的融合蛋白的制备方法，其特征在于：采用基因工程技术表达、纯化制备该蛋白，具体方法如下，埃可病毒1型VP1蛋白抗原表位的筛选及其基因片段的化学合成：利用ANTHEWIN、DNAStar等软件，通过计算机分析埃可病毒1型VP1蛋白的全氨基酸序列，筛选出2个含强抗原表位的蛋白片段，分别为第75位氨基酸至第140位氨基酸，第203位氨基酸至第236位氨基酸含有较强的抗原表位；2段蛋白片段之间通过两个甘氨酸和一个丝氨酸连接，构成总长度为103个氨基酸的融合蛋白；选择真核和原核生物均偏爱的密码子，化学合成该融合蛋白的全新基因序列；在合成的基因片段的5'端增加了BamHI的酶切位点（下画线部分），在3'端增加了终止密码子TAA和XhoI酶切位点（下画线部分），使合成的基因片段易于克隆至质粒pGEX-4T-2内的BamHI和XhoI酶切位点内；筛选的埃可病毒1型VP1蛋白内2个含强抗原表位的蛋白片段：Seqence1: 第75位aa － 第140位aa：Seqence2:第203位aa － 第236位aa：2个含强抗原表位蛋白片段连接在一起形成融合蛋白，该融合蛋白的氨基酸序列：化学合成的埃可病毒1型表面蛋白VP1抗原表位融合蛋白的DNA序列（324bp）表达埃可病毒1型VP1抗原表位融合蛋白重组质粒的构建:提取质粒pGEX-4T-2,用 BamHI和XhoI双酶切，电泳后回收酶切的质粒大片段, 溶于去离子水内；同时用BamHI和XhoI双酶切化学合成埃可病毒1型VP1抗原表位融合蛋白的基因片段，电泳回收后, 溶于去离子水内；取等摩尔浓度的上述酶切后DNA片段，在同一离心管内用T4 DNA 连接酶连接，使化学合成埃可病毒1型VP1蛋白基因片段插入到载体pGEX-4T-2内的BamHI和Xho I位点之间，与载体上的起始密码子翻译框架一致，表达一个埃可病毒1型VP1抗原表位融合蛋白；重组质粒的筛选与鉴定...
【专利技术属性】
技术研发人员：李越希，李素梅，齐勇，李佳萌，潘英，陈晨，王新国，李素芹，陈红霞，徐亦非，
申请(专利权)人：李越希，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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