一种微生物的高通量分离培养方法技术

本发明专利技术提供一种高通量分离培养微生物的方法，是将待分离的微生物先以琼脂糖为包埋材料进行第一次包埋，然后以海藻酸钠为包埋材料进行二次包埋获得微球，然后将微球用流式细胞仪进行分离。本发明专利技术的方法可以把原位样品直接加入双层球培养系统中，实现微球和原位样品共培养。这种共培养的方式不仅更容易使难培养的微生物获得培养，而且可以充分利用样品，特别针对像结核块这种量小、不易处理的样品，提高了珍贵样品的利用率。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于微生物分离培养
，具体涉及一种微生物的高通量分离培养方法。
技术介绍
随着采样技术的迅速发展，科学家们获得越来越多的珍贵的样品。如何从这些样品中高效的分离培养微生物成为世界微生物学家研究的热点问题。1887年，平板培养方法专利技术以来，该方法成为经典的方法用于微生物的分离培养。之后在1979年，科学家发现通过平板培养方法获得菌株却只是总数中极少的部分。自此人们越来越关注平板培养方法的不足之处，首先，平板中的营养成分比例和数量一般都是固定的，对于来源不同的样品，平板培养法不适合大部分菌株的生长；其次，微生物在平板中的生长是不均衡的，有些非苛养菌的生长迅速，它们可以在较短时间内迅速增殖，而一些苛养菌却生长缓慢，在有限营养的平板中，两者的不均衡生长又产生了明显的竞争关系，如非苛养菌的快速生长消耗掉大量的营养物质，使得有着营养要求的苛养菌生长更加缓慢，同时非苛养菌产生的次级代谢产物能改变平板微环境，一定程度上限制了苛养菌的生长；最后，某些种类的微生物本身不会形成肉眼可见的菌落从而得不到分离。因此，科学家们不断尝试进行各种方法来提高微生物分离培养效率，旨在获得越来越多的微生物种类。Zengler等(2002)设计了一种高通量分离培养方法，该方法结合了微球包埋技术和流式细胞仪技术，用来选择性培养和分选人工模拟系统中的未培养的细菌。具体流程为，先通过微包埋技术将单个或几个微生物细胞包埋在微球中，然后将大约百万个微球放入层析柱中进行培养，层析柱中持续通入过滤灭菌的原位水体来提供营养物质，可以生长的微生物会在微球中形成单克隆，最后用流式细胞仪筛选含有单克隆的微球进行分离培养。该技术有四点优势，首先是提供一种共培养的状态，来自同一个环境的微生物共培养在同一系统中，他们只是物理上隔离，细胞之间的信号传导和物质交流没有受到阻断；其次，整个培养环境是连续流动的培养基，一般是原位的海水等，持续的补充营养也模拟了原位环境；再次，后期的流式细胞仪筛选与微孔板的结合，很容易实现下游的扩大培养或选择性培养。与经典的海洋微生物分离培养方法相比，该方法先将微生物从环境中分离出来再进行培养，而传统的方法正好相反，是先将微生物一起培养，等长出单菌落后进行分离，截然不同的思路使得该方法获得了良
好的分离培养效果。然而，申请人多次尝试上述微生物高通量分离培养技术，在培养过程中发现上述的方法在微球培养过程中，生长迅速的微生物会长出微球，扩散到培养环境中，而流通的海水无法完全彻底的清除这些游离的微生物。这些破球而出的菌株会粘附在微球上，严重干扰流式细胞仪的分选。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种高通量分离培养微生物的方法，即一种高效获得微生物资源的方法，从而克服了目前方法中的缺点。本专利技术的方法有效的解决了单包埋方法中存在的优势菌“污染”培养系统的问题，确保用于流式细胞仪筛选的微球表面不会粘附其他微生物，增加了分离效率。本专利技术的方法，是将待分离的微生物先以琼脂糖为包埋材料进行第一次包埋，然后以海藻酸钠为包埋材料进行二次包埋获得微球，然后将微球用流式细胞仪进行分离。包括如下的步骤：1)菌悬液制备：首先将从样品中分离的菌群进行扩大培养，获得菌悬液；其中一种扩大培养的方法，是将样品放入层析柱中，用灭菌水体作为培养液进行培养，富集培养后，对培养菌液进行过滤，获得菌悬液；2)琼脂糖包埋将制备好的菌悬液加入到琼脂糖中混均制成混合液，然后将混合液滴加到液体石蜡中，进行搅拌；搅拌完毕后，立即将乳浊液倒入到冰浴中静置，待微球形成后，乳浊液中加入生理盐水，再进行离心收集微球；所述的生理盐水为0.85％的NaCl水溶液；3)制备海藻酸钠微球将步骤2)制备的微球加到海藻酸钠溶液中，混均后滴加到CaCl2溶液中，待其全部滴加完毕后静置处理，收集微球，冲洗微球后进行层析柱培养；层析柱中加入最初分离菌群的样品为微生物的生长提供原位的生长所需物质，并通入灭菌水体提供营养物质；4)培养后微球的筛选将步骤3)的微球在层析株中培养不少于3周后，收集微球，将微球加到含0.85％NaCl的50mM EDTA溶液中使微球溶解直至肉眼看不到为止；用滤
膜进行过滤，过滤后微球可用流式细胞仪进行筛选；所述的过滤，是先用20μm的筛绢进行过滤，收集的微球再通过70μm的筛绢过滤；5)微生物的富集培养及分离纯化鉴定筛选后的微球通过加富培养基培养，使微球内部细菌增殖后长破微球并在孔板中富集，再进行纯化。其中加富培养基采用的是2216E、R2A、SPGN、SPGS或K培养基。本专利技术的方法可以把原位样品直接加入双层球培养系统中，实现微球和原位样品共培养。这种共培养的方式不仅更容易使难培养的微生物获得培养，而且可以充分利用样品，特别针对像结核块这种量小、不易处理的样品，提高了珍贵样品的利用率。附图说明图1：双包埋培养法示意图，图2：双层球的显微观察(A，4倍物镜观察；B，10倍物镜观察)，图3：单包埋法微球显微观察(A)和双包埋法外层溶解后收集到的内部微球显微观察(B)，图4：双包埋法微球培养后显微观察(A，普通光镜观察观察内部微球中形成单克隆；B，用SYTO-9荧光染料染色后荧光显微镜观察)，图5：双包埋法微生物长破内部微球显微观察(A和B)和外层微球对环境微生物的阻隔效果显微观察(C和D)，(从A和B图可以看出，被包埋的微生物长破内部微球后未发生扩散；从C和D图可以看出，从高浓度菌液环境中取出的双层球，微生物几乎都被阻隔在外层材料外面)，图6：多金属结核样品高通量分离培养的菌株进化树，图7：多金属结核样品高通量分离部分菌株锰微生物锰氧化能力检测(A，HK032；B，HK082；C，HK002-3；D，HK071；E，HK048；F，HK024-1；G，阴性对照；H，HRA130-1；I，HMA139-2)。具体实施方式下面结合实例对本专利技术的方法进行详细的描述。实施例11)菌悬液制备多金属结核样品采集自2013年东太平洋结核区PRZ1302-MC12(154°49.8218′W，10°29.2573′N)站，水深有5098m。采样器获得样品后，立
即放入无菌密封袋中，4℃黑暗保存。在实验室，取结核样品一块(直径1～2cm)，放入15ml层析柱中，加入无菌过滤海水(补充1mM NH4Cl)，10℃黑暗富集6个月，每月用7ml新鲜无菌的海水(补充1mM NH4Cl)进行培养液的更换。富集培养完毕后，取培养液1ml过滤到0.22μm微孔滤膜上进行微生物细胞计数。根据计数结果，通过样品浓缩获得浓度大约为107cells/ml的菌悬液。进行双包埋培养(流程如图1)。2)琼脂糖包埋在50ml大离心管中加入20ml液体石蜡(含1％的Span 80)，之后把预先配好并除菌的琼脂糖(3.5％，w/v)融化后，与装有液体石蜡的大离心管及菌悬液统一放在室温(28℃)或28℃水浴锅进行保温(Sigma IX-A型琼脂糖属于超低温琼脂糖，凝固温度28℃以下)，搅拌混匀。转速为1000rpm，首先预转2min，期间将200μl菌悬液加入1ml液态的琼脂糖中混匀，且避免出现气泡。之后调整转速到1800rpm，并用1ml枪头在液体石蜡中逐滴加入琼脂糖-菌混合液1ml，保持转速不变继续本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高通量分离培养微生物的方法，其特征在于，所述的方法是将待分离的微生物先以琼脂糖为包埋材料进行第一次包埋，然后以海藻酸钠为包埋材料进行二次包埋获得微球，然后将微球用流式细胞仪进行分离。

【技术特征摘要】
1.一种高通量分离培养微生物的方法，其特征在于，所述的方法是将待分离的微生物先以琼脂糖为包埋材料进行第一次包埋，然后以海藻酸钠为包埋材料进行二次包埋获得微球，然后将微球用流式细胞仪进行分离。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的方法包含如下的步骤：1)菌悬液制备：首先将从样品中分离的菌群进行扩大培养，获得菌悬液；2)琼脂糖包埋：将制备好的菌悬液加入到琼脂糖中混均制成混合液，然后将混合液滴加到液体石蜡中，进行搅拌；搅拌完毕后，立即将乳浊液倒入到冰浴中静置，待微球形成后，乳浊液中加入生理盐水，再进行离心收集微球；3)制备海藻酸钠微球：将步骤2)制备的微球加到海藻酸钠溶液中，混均后滴加到CaCl2溶液中，待其全部滴加完毕后静置处理，收集微球，冲洗微球后进行层析柱培养；层析柱中加入最初分离菌群的样品为微生物的生长提供原位的生长所需物质，并通入灭菌水体提供营养物质；4)培养后微球的筛选：将步骤3)的微球...

【专利技术属性】
技术研发人员：张晓华，张增虎，武彦宏，刘晨光，肖天，赵苑，李诚博，
申请(专利权)人：中国海洋大学，
类型：发明
国别省市：山东;37