本发明专利技术属于基因工程和遗传修饰领域，具体的说，涉及一种人类单纯疱疹I型病毒UL‑7基因突变减毒株、构建方法及应用，本发明专利技术完善了制备HSVI UL‑7突变减毒株的技术过程及验证指标。在获得UL‑7基因突变株后，为其减毒特征做了相应的检测确证。同时，对该突变株病毒做为HSVI减毒活疫苗应用的可能性做了相应的探讨。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程和遗传修饰领域，具体的说，涉及一种人类单纯疱疹I型病毒UL-7基因突变减毒株、构建方法及应用。
技术介绍
人类单纯疱疹病毒I型(Herpes Simplex Virus I,HSVI)作为一种影响人类健康的重要病毒病原体，已为我们认识多年。其感染人体所引起的疾病——单纯疱疹，主要发生于口唇部皮肤。同时亦日益多见于生殖器皮肤。而后者多由于单纯疱疹病毒II型病毒(HSVII)感染所引起。HSVI感染疾病的严重性在于其不仅导致表现为激烈疼痛的口唇部疱疹，同时更重要的是该病毒可进入以三叉神经为主要受损组织的神经细胞中，并在其中形成潜伏感染而形成对人类机体健康的终身影响。因此，对该病毒性的传染病的预防和治疗具有重要的公共卫生意义。但迄今为止，HSVI疫苗研究未见明显进展，其主要原因为：首先，HSVI基因结构复杂，因此采用传统的减毒技术难以获得具有明确生物学指标的减毒疫苗毒株，同时，其有效性和安全性指标都难以建立。其次，灭活疫苗始终未能展现有效的免疫原性，而使用基因操作方式制备的多肽疫苗，如HSVI衣壳颗粒蛋白gB、gD、gC等的亚单位疫苗亦均未在 临床试验中获得临床保护性结果。因此，基于现有的技术，采用基因操作方法，构建位点明确，具有生物学功能的突变病毒株，使其增殖毒力，尤其是对神经细胞感染能力表现明显突变的技术策略是目前被认同的疫苗研究路线。Crispr/cas 9基因修饰技术的应用为这一种HSVI疫苗的研究提供了可能。
技术实现思路
为了克服上述缺陷，本专利技术的目的是提供具有有效免疫原性和安全性的人类单纯疱疹I型病毒UL-7基因突变减毒株。本专利技术的另一个目的为提供具有有效免疫原性和安全性的人类单纯疱疹I型病毒UL-7基因突变减毒株的构建方法。本专利技术的又一个目的为提供人类单纯疱疹I型病毒UL-7基因突变减毒株作为疫苗候选株的应用。人类单纯疱疹I型病毒UL-7基因突变减毒株，于2016年4月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号为CGMCC No.12254，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号 。人类单纯疱疹I型病毒UL-7基因突变减毒株的构建方法，包括如下步骤：a.设计UL7基因编码序列的gRNA引物，分别为1F：5'-CACCGTGCGGCCAGTCCAGTTATCG-3’1R：3’-AAACCGATAACTGGACTGGCCGCAC-5'2F：5’-CACCGGCGGTCCTGACGGCCAACG-3'2R：3’-AAACCGTTGGCCGTCAGGACCGCC-5'；将合成后的1F和1R 单链oligo DNA、2F和2R单链oligo DNA分别退火形成双链DNA；b.酶切PX330质粒并纯化；酶切纯化的PX330质粒分别连接1F和1R的退火产物、2F和2R的退火产物得到第一连接产物和第二连接产物；第一连接产物和第二连接产物分别转化感受态大肠杆菌，培养大肠杆菌以获得单菌落；c.分别挑取含有第一连接产物或第二连接产物的单菌落并培养、再进行菌液PCR鉴定，得到分别含有PX330-UL7-1和PX330-UL7-2的菌液，分别进行PX330-UL7-1和PX330-UL7-2质粒提取；d.用转染试剂将质粒PX330-UL7-1和PX330-UL7-2同时转染人胚胎肾细胞系293T细胞；e.转染后16-20小时，以病毒感染复数moi＝0.5的HSV-1对转染后的293T细胞进行感染；病毒感染时，从细胞培养板中吸出培养基，使用PBS清洗细胞后接种病毒；37℃培养箱中使病毒孵育30-60min后弃病毒液，加入1-3％FBS的细胞培养液至细胞产生病变后收获病毒。在步骤a中，取1F、1R各2ul，去离子水46ml，90-95℃反应8min进行退火，自然冷却至室温，-20℃储存备用；取2F、2R各2ul，去离子水46ml，90-95℃反应8min进行退火，自然冷却至室温，-20℃储存备用。在步骤b中，使用限制性内切酶对PX330质粒进行酶切，酶切体系为:PX330质粒15ul，Bbs1 2ul，缓冲液3ul，去离子水5ul，37℃孵箱酶切4-6小时；酶切产物用1.2％琼脂糖凝胶电泳进行胶回收纯化；1F和1R的退火产物、2F和2R的退火产物分别插入CRISPR/Cas9系统pX330载体的Bbs1部位；反应体系：T4DNA连接酶1ul，10X T4连接酶缓冲液1ul，双链DNA 2ul，PX330质粒酶切产物2.5ul，去离子水3.5ul，16℃连接4-6小时后取5-10ul用于大肠杆菌的转化；将DH5a感受态细胞100ul置于冰上，解冻后加入5-10ul连接产物混匀，冰浴30min，42℃热激后迅速置于冰上5min，加入1000ul LB培养基，37℃100-200rpm震荡复苏60min；取100ul复苏液直接涂布于含100ug/ml氨苄抗性的LB-agar平板上37℃培养直至单菌落长出。在步骤c中，挑取单菌落于5-10ml LB培养基中37℃100-200rpm震荡培养8-12h后进行菌液PCR鉴定；菌液PCR所用上游引物为从PX330质粒上合成的一条引物PX330-sense(序列为5'-GAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTC-3',),下游引物即为1R和2R，PCR反应体系如下：菌液5ul，PX330-sense 1ul，1R或2R 1ul，Premix 10ul，去离子水3ul；PCR产物进行2％的琼脂糖凝胶电泳分析目的条带。在步骤d中，293T细胞消化后用DMEM培养基重悬混匀分散细胞悬液至形成单个细胞；用细胞计数板进行计数后以每孔1X105/3ml DMEM细胞的数量铺种入6孔板中。在步骤e中，收获病毒后对收获的病毒液超声破碎10min，5000rpm离心5min后收集上清，分装后保存于-80℃。我们首先对HSVI基因编码的多种蛋白的生物学功能做了分析，并从中观察到HSVI编码的UL-7蛋白，在病毒感染神经细胞及引起中枢神经系统组织细胞病变过程中具有重要的作用，而对该基因的修饰突变，使其丧失原有功能后，可以和野生型病毒相较表现如下的生物学功能的改变：(1)病毒感染体外培养的神经细胞能力降低。(2)病毒感染小鼠及猕猴后不引起相似的临床症状。(3)不引起动物中枢神经系统 的系统性病理改变。(4)同时仍然引起机体对病毒的免疫反应，主要以血清中和抗体及IFN-r特异T细胞，针对HSVI感染的Elispot阳性反应为特征。基于这些发现，我们进一步完善了制备HSVI UL-7突变减毒株的技术过程及验证指标。在获得一株UL-7基因突变株后，为其减毒特征做了相应的检测确证。同时，对该突变株病毒做为HSVI减毒活疫苗应用的可能性做了相应的探讨。附图说明图1为UL7基因的PCR产物检测结果，矩形框所示为一个UL7基因缺失30bp的突变毒株：HSVI－MU－UL7。图2(A)37℃和(C)34℃条件下突变株与野毒株在Vero细胞上以moi＝1接种后的病毒生长动力学曲线；(B)37℃条件下不同病毒株在Vero细胞上以moi＝0.00001接种后，固定及染色3天后的蚀斑形态。图3为野毒株和突变株感染后引起小鼠CNS的病理改变示意图：大脑实质明显本文档来自技高网...
【技术保护点】
人类单纯疱疹I型病毒UL‑7基因突变减毒株，于2016年4月12日保藏于中国微生物菌株保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号为CGMCC No.12254。
【技术特征摘要】
1.人类单纯疱疹I型病毒UL-7基因突变减毒株，于2016年4月12日保藏于中国微生物菌株保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号为CGMCC No.12254。2.人类单纯疱疹I型病毒UL-7基因突变减毒株的构建方法，包括如下步骤：a. 设计UL7基因编码序列的gRNA引物，分别为1F：5'-CACCGTGCGGCCAGTCCAGTTATCG-3’1R：3’-AAACCGATAACTGGACTGGCCGCAC-5'2F：5’-CACCGGCGGTCCTGACGGCCAACG-3'2R：3’-AAACCGTTGGCCGTCAGGACCGCC-5'；将合成后的1F和1R单链oligo DNA、2F和2R单链oligo DNA分别退火形成双链DNA；b.酶切PX330质粒并纯化；酶切纯化的PX330质粒分别连接1F和1R的退火产物、2F和2R的退火产物得到第一连接产物和第二连接产物；第一连接产物和第二连接产物分别转化感受态大肠杆菌，培养大肠杆菌以获得单菌落；c．分别挑取含有第一连接产物或第二连接产物的单菌落并培养、再进行菌液PCR鉴定，得到分别含有PX330-UL7-1和PX330-UL7-2的菌液，分别进行PX330-UL7-1和PX330-UL7-2质粒提取；d．用转染试剂将质粒PX330-UL7-1和PX330-UL7-2同时转染人胚胎肾细胞系293T细胞；e．转染后16-20小时，以病毒感染复数moi=0.5的HSV-1 对转染后的293T细胞进行感染；病毒感染时，从细胞培养板中吸出培养基，使用PBS清洗细胞后接种病毒；37℃培养箱中使病毒孵育30-60min后弃病毒液，加入1-3% FBS 的细胞培养液至细胞产生病变后收获病毒。3.根据权利要求2所述的人类单纯疱疹I型病毒UL-7基因突变减毒株的构建方法，其特征在于，在步骤a中，取 1F、1R各2ul，去离子水46ml，90-95℃反应8min进行退火，自然冷却至室温，-20℃储存备用；取 2F、2R各2ul，去离子水46ml，90-95℃反应8min进行退火，自然冷却至室温，-20℃储存备用。4.根据权利要求2所述的人类单纯疱疹I型病毒UL-7基因突变减毒株的构建方法，其特征在于，在步骤b中，使用限制性内切酶对PX...
【专利技术属性】
技术研发人员：徐兴丽，冯敏，李一濛，
申请(专利权)人：康普润苏州生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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