本发明专利技术涉及一种A型副鸡禽杆菌免疫保护性抗原及其应用。本发明专利技术获得的人工A型副鸡禽杆菌免疫保护性抗原蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，命名为P41。该蛋白具有很强的免疫原性，利用所述抗原蛋白制备的亚单位疫苗，能够明显增强鸡对A型副鸡禽杆菌的抵抗力，其保护效果优于全菌灭活疫苗，可有效预防副鸡禽杆菌的感染。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于家禽传染病疫苗制备
，尤其涉及一种A型副鸡禽杆菌免疫保护性抗原及其应用。
技术介绍
副鸡禽杆菌(Avibacterium paragallinarum，Apg)为巴氏杆菌科的一种短小革兰氏阴性杆菌，基本特征为无运动性、菌体呈多形性、强毒株带有荚膜。1932年De Blieck首先报道了自鼻道和鼻窦黏膜具有急性卡他性炎症、面部水肿和结膜炎的鸡群中首次分离出一种革兰氏阴性杆菌。最初的研究报道指出该病原菌生长条件中既需要X(血红素晶)因子，也需要V(烟酰胺腺嘌啉二核苷酸，NAD)因子，早期的研究者将其命名为鸡嗜血杆菌(Haemophilus gallinarum)。1962年，Page等人研究发现所有IC病例的分离株生长只需要V因子。因此，有学者提议将只需要V因子的鸡嗜血杆菌命名为—个新种：副鸡嗜血杆菌(H.paragallinarum)，并被广泛接受。近年来，在南非、墨西哥等地已从患鼻炎的鸡中分离到不依赖V因子的副鸡嗜血杆菌菌株。因此，严格按照在体外生长因子需要进行嗜血菌的分类并不科学。2005年，Blackall等将副鸡嗜血杆菌的名称改为副鸡禽杆菌(Avibacterium paragallinarum)。副鸡禽杆菌作为鸡的一种重要的呼吸道病原菌，常引起鸡的传染性鼻炎(infectious coryza,IC)，该病在世界范围内广泛传播，给养鸡业造成愈来愈严重的经济损失。目前国内已有许多养鸡场发生该病的报道。从感染部位来看，副鸡禽杆菌感染的是呼吸系统中最前沿的部位--鼻道和鼻窦黏膜，可以说是呼吸道疾病的门户病。这第一屏障被破坏，其他病原的感染率就大大增加。若与其它病原如鸡传染性支气管炎病毒、鸡支原体、鸡传染性喉气管炎等并发感染后引起鸡呼吸道疾病综合征，会给养鸡业造成更大的损失。各种日龄的鸡都易感该菌，常见于13周龄以上的鸡，通常表现为低死亡率和高发病率，产蛋率下降10％～40％。该病病理变化主要表现在上呼吸道急性卡它性炎症典型症状是黏液性鼻窦炎，鼻窦黏膜水肿充血、黏膜杆状细胞渗出，并且伴随有异噬性白细胞和巨噬细胞，产生典型的鼻炎病变。临床表现为面部单侧或双侧肿胀、流鼻涕，食欲下降、产蛋率下降。鸡传染性鼻炎是一种呼吸道传染病，目前主要靠灭活疫苗来控制。灭活疫苗的免疫效果可能与所激发的黏膜抗体相关。研究表明A、B、C三个血清型的Apg均有不同程度的致病力，但三者的灭活菌体不存在型间交叉免疫，只存在型内交叉免疫保护。目前国际上普遍使
用的灭活疫苗绝大多数都包含了A型和C型，随着国内外陆续发现有大量B型Apg的流行和发生，国际上影响较大的疫苗公司已经开始提供包含A、B、C三种血清型的三价灭活疫苗。另一方面，由于副鸡禽杆菌含有LPS等毒素物质，大量接种所带来毒副作用也会影响鸡的产蛋与生长，因此导致了生产上免疫失败时有发生。鸡传染性鼻炎灭活疫苗对野外鸡群感染的预防效果大约为70-80％，在其效力检验中由于环境和评价方法的不尽一致可能会有不同的结果。因此，需要研究更为安全有效的副鸡禽杆菌疫苗，既不影响鸡的产蛋与生长，又能提高对鸡传染性鼻炎的防疫效果。
技术实现思路
为弥补现有的副鸡禽杆菌疫苗免疫效果欠佳的不足，本专利技术提供一种人工A型副鸡禽杆菌免疫保护性抗原蛋白，该抗原蛋白免疫原性强，能够覆盖多种副鸡禽杆菌变异株，利用该抗原蛋白可制备对A型副鸡禽杆菌预防效果显著的亚单位疫苗。本专利技术请求保护的技术方案如下：一种人工A型副鸡禽杆菌免疫保护性抗原蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。一种A型副鸡禽杆菌亚单位疫苗，其特征在于，其活性组分包括权利要求1所述的人工A型副鸡禽杆菌免疫保护性抗原蛋白。所述A型副鸡禽杆菌亚单位疫苗，其特征在于，所述人工A型副鸡禽杆菌免疫保护性抗原蛋白的终浓度为10μg/ml。用于编码所述人工A型副鸡禽杆菌免疫保护性抗原蛋白的基因。所述基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。一种表达权利要求1所述的人工A型副鸡禽杆菌免疫保护性抗原蛋白的重组表达载体，其特征在于，其表达外源蛋白的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。所述重组表达载体是大肠杆菌重组表达载体pET28a-P41，是利用NcoI和XhoI酶切获得SEQ ID NO：2所示的核苷酸片段，并连接到pET28a的NcoI与XhoI酶切位点之间所得。一种表达权利要求1所述的人工A型副鸡禽杆菌免疫保护性抗原蛋白的重组大肠杆菌菌株，其特征在于，其包含权利要求7所述的重组表达载体pET28a-P41。权利要求1所述的人工A型副鸡禽杆菌免疫保护性抗原蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：获得权利要求6或7所述的重组表达载体，导入到表达系统中诱导表达获得所述人工A
型副鸡禽杆菌免疫保护性抗原蛋白。本专利技术利用在线抗原表位预测软件http://www.cbs.dtu.dk/services/BepiPred/，对A型副鸡禽杆菌Hmtp210的基因(GenBank:KJ867495.1，全长6129bp)及其全蛋白序列(2042个氨基酸残基)进行抗原表位分析，筛选免疫原性较强的抗原表位，并根据经验截取其中部分抗原表位，以便所得的抗原蛋白的大小适合于大量制备并具有良好的免疫活性，最后将优化的各抗原表位进行拼接，获得了SEQ ID NO：1所示的一段融合肽，作为人工A型副鸡禽杆菌抗原蛋白，命名为P41。对该抗原蛋白P41的抗原特性进行实验分析，Western Blotting实验证明了该抗原蛋白具有较好的免疫原性，使用该抗原蛋白免疫试验鸡后能保护试验鸡只不受同型副鸡禽杆菌感染。实验数据还表明，该抗原蛋白P41能够针对多株流行的副鸡禽杆菌，如Hp8、221、0083等A型菌株，且保护效果优于全菌常规灭活疫苗。利用本专利技术的抗原蛋白P41制备亚单位疫苗，能够明显增强鸡对副鸡禽杆菌的抵抗力，有效预防副鸡禽杆菌的感染。在本专利技术的一个实施例中，攻毒保护率实验表明，采用P41抗原蛋白免疫的鸡群在A型副鸡禽杆菌攻毒后，所有鸡只没有出现鼻炎症状，保护率为100％；采用全菌常规灭活疫苗免疫的鸡群在攻毒后3天内有2-3只鸡出现临床症状，保护率为70～80％；而未进行免疫的对照组鸡群在攻毒后全部出现鼻炎症状，发病率为100％。免疫组与非免疫组的保护率有极显著差异。因此，本专利技术的抗原蛋白是一种很好的免疫保护性抗原，其保护效果优于全菌灭活疫苗，可以作为副鸡禽杆菌亚单位疫苗的候选抗原。本专利技术还提供一种副鸡禽杆菌亚单位疫苗，其活性组分包括上述副鸡禽杆菌抗原蛋白P41。在本专利技术的一些实施例中，将所述抗原蛋白P41与弗氏完全佐剂或不完全佐剂进行等体积混合乳化，制备副鸡禽杆菌亚单位疫苗。在本专利技术的另一些实施例中，所述抗原蛋白P41还可以与本领域已知的能够作为禽类疫苗的其它蛋白或灭活菌联用，制备联合疫苗。所述亚单位疫苗中副鸡禽杆菌抗原蛋白的终浓度优选为10μg/ml。本专利技术还提供所述人工A型副鸡禽杆菌免疫保护性抗原蛋白的制备方法。其表达系统可以采用原核表达系统或真核表达系统，原核表达系统优选大肠埃希氏菌BL21(DE3)，真核表达系统可以是酵母菌或原生质体。相应地，选用与之匹配的表达载体、转化条件、表达条件及蛋本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种人工A型副鸡禽杆菌免疫保护性抗原蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
【技术特征摘要】
1.一种人工A型副鸡禽杆菌免疫保护性抗原蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。2.一种A型副鸡禽杆菌亚单位疫苗，其特征在于，其活性组分包括权利要求1所述的人工A型副鸡禽杆菌免疫保护性抗原蛋白。3.根据权利要求2所述的A型副鸡禽杆菌亚单位疫苗，其特征在于，所述人工A型副鸡禽杆菌免疫保护性抗原蛋白的终浓度为10μg/ml。4.用于编码权利要求1所述的人工A型副鸡禽杆菌免疫保护性抗原蛋白的基因。5.根据权利要求4所述的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。6.一种表达权利要求1所述的人工A型副鸡禽杆菌免疫保护性抗原蛋白的重组表达载体，其特征在于，其表达外源蛋白的基因的核...
【专利技术属性】
技术研发人员：王宏俊，李淑芳，龚玉梅，张培君，李桂萍，
申请(专利权)人：北京市农林科学院，
类型：发明
国别省市：北京;11
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