一种提高AdEasy腺病毒载体系统重组效率的方法技术方案

本发明专利技术公开了一种提高AdEasy腺病毒载体系统重组效率的方法，属于生物工程领域。将腺病毒载体pAdEasy与连接有目的基因的pAdtrack‑CMV重组载体共转化携带pKD46质粒的BJ5183感受态细胞，然后在培养基中培养；所述的携带pKD46质粒的BJ5183感受态细胞在制备过程中经过L‑阿拉伯糖诱导。本发明专利技术使得腺病毒载体pAdEasy与pAdtrack‑CMV的重组发生在能表达Red重组酶的菌体中，在L‑阿拉伯糖诱导的条件下使其稳定地表达Red重组酶，重组酶能促进同源基因序列完成重组，大大提高了AdEasy腺病毒载体系统的重组效率。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物工程领域，具体涉及一种提高AdEasy腺病毒载体系统重组效率的方法。
技术介绍
腺病毒是一种线型双链DNA无包膜病毒，它的DNA和核心蛋白形成内核，蛋白外壳是直径约80nm的正二十面体，由240个六面体和12个位于正二十面体顶部的五面体构成。它通过受体介导的内吞作用进入细胞内，然后腺病毒基因组转移至细胞核内，进行靶标蛋白的表达，不整合进入宿主细胞基因组中。重组腺病毒是在体外和活体用于蛋白药物表达的常见病毒载体，体外构建和包装腺病毒载体是产生重组腺病毒颗粒的重要步骤。其中，体外构建携带目标蛋白基因的腺病毒骨架基因载体是包装腺病毒颗粒的先决条件。传统的AdEasy腺病毒载体重组系统通过E.coli BJ5183载有的recET基因(RecE通路)实施保守性双链DNA断裂修复，从而具有高度基因同源重组活性，且稳定传代的特点。recE编码一种核酸外切酶；recT编码一种结合于ssDNA促使链交换的蛋白。传统的腺病毒载体重组系统很不稳定，产生阳性重组子的效率并不高，而且筛选的工作量比较大。Red重组系统属于λ噬菌体的重组系统，其编码基因exo、bet和gam置于PL操纵子的控制之下。exo基因的产物是λ核酸外切酶，它可将dsDNA5’端切开，产生3’端突出。bet基因编码的β蛋白，可与ssDNA结合促进互补链的复性，并可以介导DNA链退火和交换反应。它在溶液中的游离状态为环状物，当结合到ssDNA时形成大的环状物，当结合到dsDNA时形成螺旋状纤维。gam基因的产物是一个分子量为16000Da的多肽，结合到宿主的RecBCD蛋白，形成二聚体，抑制RecBCD的外切酶活性。
技术实现思路
鉴于现有技术的上述不足，本专利技术的目的是提供一种提高AdEasy腺病毒载体系统重组效率的方法。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种提高AdEasy腺病毒载体系统重组效率的方法，包括如下步骤：将腺病毒载体pAdEasy与连接有目的基因的pAdtrack-CMV重组载体共转化携带pKD46
质粒的BJ5183感受态细胞，然后在培养基中培养。所述的携带pKD46质粒的BJ5183感受态细胞在制备过程中经过L-阿拉伯糖诱导。优选的，所述的提高AdEasy腺病毒载体系统重组效率的方法，具体包括如下步骤：(1)将pKD46质粒转化到BJ5183中，获得含有pKD46质粒的BJ5183菌株，利用L-阿拉伯糖诱导其产生Red重组酶并且将其制备成感受态细胞。(2)将腺病毒载体pAdEasy与连接有目的基因的pAdtrack-CMV重组载体共转化步骤(1)制备的感受态细胞，热击、冰浴后加入液体培养基先培养使细菌恢复正常生长状态并且表达质粒编码的抗生素基因，再涂布到含卡那霉素(Kan)的固体培养基培养去除pKD46质粒。挑取固体培养基上生长的单菌落培养、提取质粒得到重组腺病毒载体。本专利技术利用pKD46质粒，构建出含有Red重组系统的BJ5183菌株，使得腺病毒载体pAdEasy与pAdtrack-CMV的重组发生在能表达Red重组酶的菌体中，在L-阿拉伯糖诱导的条件下使其稳定地表达Red重组酶，重组酶能促进同源基因序列完成重组，大大提高了AdEasy腺病毒载体系统的重组效率(产生的重组腺病毒载体的酶切鉴定阳性效率可以达到100％)，为今后重组腺病毒载体构建提供了很大的方便。附图说明图1是对照组1重组提取的重组腺病毒载体电泳图。1-7是重组腺病毒载体pAdeasy-GFP的质粒，质粒大小全部正确；M是DL10000。图2是PacI酶切鉴定对照1重组提取的重组腺病毒的电泳图。1-7是PacI酶切重组腺病毒载体pAdeasy-GFP质粒的产物，阳性载体经酶切后只有3和7为阳性，酶切鉴定阳性率28.6％；M是DL10000。图3是实验组1重组提取的重组腺病毒载体电泳图。1-7是重组腺病毒载体pAdeasy-GFP的质粒，大小全部正确；M是DL15000。图4是PacI酶切鉴定实验组1重组提取的重组腺病毒载体的电泳图。1-7是PacI酶切重组腺病毒载体pAdeasy-GFP质粒的产物；阳性载体经酶切后全部为阳性重组子，酶切鉴定阳性率100％；M是DL15000。图5是实验组2重组提取的重组腺病毒载体电泳图。1-7是重组腺病毒载体pAdeasy-GFP/DrsB2的质粒，1、2、3、4、7质粒大小正确；M是DL15000。图6是PacI酶切鉴定实验组2重组提取的重组腺病毒载体的电泳图。1-7是PacI酶切重组腺病毒载体pAdeasy-GFP/DrsB2质粒的产物，阳性载体经酶切后全部为阳性重组子，酶切鉴定阳性率100％；M是DL15000。图7是对照组2重组提取的重组腺病毒载体电泳图。1-8是重组腺病毒载体pAdeasy-GFP的质粒，1、2、6质粒大小正确；M是DL15000。图8是PacI酶切鉴定对照组2重组提取重组腺病毒载体的电泳图。1-8是PacI酶切重组腺病毒载体pAdeasy-GFP质粒的产物，载体经酶切后2和3是阳性，酶切鉴定阳性率25％；M是DL15000。具体实施方式应用AdEasy腺病毒载体系统，以往的方法是将pAdEasy-1质粒和线性化pAdtrack-CMV和共转化BJ5183感受态中，或者将线性化pAdtrack-CMV转化到含有pAdEasy-1质粒的BJ5183感受态中。本专利技术是将线性化pAdtrack-CMV和pAdEasy-1质粒共转化含有Red重组酶的BJ5183感受态中。下面结合实施例对本专利技术做进一步详细的描述，但本专利技术的实施方式不限于此。实施例1一、携带pKD46质粒的BJ5183感受态细菌的制备(1)从平板挑取用普通转化方法获得的携带pKD46质粒的BJ5183菌株单菌落接种到4mL含有Amp(终浓度25-50μg/mL)的SOB培养基中，30℃、220rpm，振荡培养过夜。(2)实验组感受态细胞：取1mL(接种量1％～2％)培养物接种到装100mL含有Amp(终浓度25-50μg/mL)SOB培养基的250mL锥形瓶中，30℃、220rpm，先振荡培养1h，然后加入L-阿拉伯糖(终浓度0.2％)诱导培养至OD600＝0.4～0.5。对照组感受态细胞：除不加入L-阿拉伯糖诱导外，其余操作同上。(3)在已灭菌的超净台中将培养好的菌液转移到2个已灭菌的50mL离心管中，冰浴30min。(4)4℃、4100rpm离心10min。在超净台中弃去上清液，倒置在滤纸上使液体尽可能流尽。(5)先分别用0.5mL冷的0.1mol/L的CaCl2溶液悬浮菌体(菌体朝上用手轻轻拍打混匀至菌液呈云雾状)，再加CaCl2溶液至30mL混匀，冰浴90min。(6)4℃、4100rpm离心10min。在超净台中弃去上清液，倒置在滤纸上使液体尽可能流尽。(7)先分别用0.5mL冷的0.1mol/L的CaCl2溶液悬浮菌体(菌体朝上用手轻轻拍打混匀至菌液呈云雾状)，再加CaCl2溶液至30mL混匀，冰浴60min。(8)4℃、4100rpm离心10min。在超净台中弃去上清液，倒置在滤纸上使液体尽可能流尽。(9)先分别用0.5mL冷的甘油CaCl2溶液(0.1mol/L CaCl2与甘油体积比85∶1本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种提高AdEasy腺病毒载体系统重组效率的方法，其特征在于：将腺病毒载体pAdEasy与连接有目的基因的pAdtrack‑CMV重组载体共转化携带pKD46质粒的BJ5183感受态细胞，然后在培养基中培养；所述的携带pKD46质粒的BJ5183感受态细胞在制备过程中经过L‑阿拉伯糖诱导。

【技术特征摘要】
1.一种提高AdEasy腺病毒载体系统重组效率的方法，其特征在于：将腺病毒载体pAdEasy与连接有目的基因的pAdtrack-CMV重组载体共转化携带pKD46质粒的BJ5183感受态细胞，然后在培养基中培养；所述的携带pKD46质粒的BJ5183感受态细胞在制备过程中经过L-阿拉伯糖诱导。2.一种提高AdEasy腺病毒载体系统重组效率的方法，其特征在于：包...

【专利技术属性】
技术研发人员：张军林，田驰，郭书奎，郭晓红，李毅，
申请(专利权)人：武汉生物工程学院，
类型：发明
国别省市：湖北;42