本发明专利技术公开一种低温木糖苷酶HJ14GH43及其耐盐突变体，木糖苷酶氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，编码木糖苷酶HJ14GH43的木糖苷酶基因hJ14GH43的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；耐盐突变体氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。本发明专利技术木糖苷酶HJ14GH43的最适pH为7.0，最适温度为25℃；本发明专利技术在木糖苷酶HJ14GH43的基础上进性定点突变，将其322位的缬氨酸突变为天冬氨酸，获得突变体V322D，突变体V322D在NaCl中的活性和稳定性都得到了提高。本发明专利技术的HJ14GH43及其耐盐突变体V322D可应用于食品行业及水产饲料中。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术公开一种低温木糖苷酶及其耐盐突变体，属于基因工程及蛋白质改造
技术介绍
木聚糖是半纤维素中最丰富的一种多糖，完全水解木聚糖需要多种酶的协同作用，包括内切木聚糖酶(endo-1,4-β-D-xylanase，EC3.2.1.8)和木糖苷酶(β-D-xylosidase，EC 3.2.1.37)等(Collins et al.FEMS Microbiol Rev,2005,29:3–23.)。内切木聚糖酶可随机地切割木聚糖的主链骨架，生成低聚木糖，而木糖苷酶可将低聚木糖水解为木糖(Collins et al.FEMS Microbiol Rev,2005,29:3–23.)。木聚糖酶在饲料、食品、酿酒、纺织及造纸等领域都具有应用价值(Collins et al.FEMS Microbiol Rev,2005,29:3–23.)。耐盐酶在高浓度NaCl下仍然具有催化活性和稳定性，可应用于高盐食品和海产品加工及其它高盐环境生物
，在高盐环境下加工食品还可以防止微生物的污染、节省灭菌等所消耗的能源(Margesin et al.Extremophiles,2001,5:73–83.)；低温酶在低温环境中具有较高的酶活，可用于低温到中温的生境或加工过程，如水产生境常常为10–25℃，将中温或者高温加工的过程转为低温加工过程还可起到降低能耗的作用(Beg et al.Appl Microbiol Biotechnol,2001,56:326–338.)。近年来，低温内切木聚糖酶和耐盐内切木聚糖酶已有报导，但低温木糖苷酶和耐盐木糖苷酶都无报导。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种低温木糖苷酶HJ14GH43及其耐盐突变体V322D。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案是：一种具有低温活性的木糖苷酶HJ14GH43，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。本专利技术低温木糖苷酶HJ14GH43可得自芽孢杆菌(Bacillus sp.)。本专利技术还提供一种编码木糖苷酶HJ14GH43的木糖苷酶基因hJ14GH43，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。本专利技术通过基因组测序的方法克隆了木糖苷酶基因hJ14GH43。本专利技术还提供一种包含有木糖苷酶基因hJ14GH43的重组载体。优选为pEasy-E1-hJ14GH43。将本专利技术的木糖苷酶基因插入到表达载体中，使其核苷酸序列与表达调控序列相连接。作为本专利技术的一个最优选的实施方案，将本专利技术的木糖苷酶基因和表达载体pEasy-E1通过T-A方式相连接，得到重组大肠杆菌表达质粒pEasy-E1-hJ14GH43。本专利技术还提供一种包含有木糖苷酶基因hJ14GH43的重组菌，所述重组菌为大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌中的一种。重组菌株BL21(DE3)/hJ14GH43。本专利技术制备木糖苷酶HJ14GH43的方法按以下步骤进行：1)用上述的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；2)培养重组菌株，诱导重组木糖苷酶表达；3)回收并纯化所表达的木糖苷酶HJ14GH43。其中，优选所述宿主细胞为大肠杆菌细胞，优选将重组大肠杆菌表达质粒转化大肠杆菌细胞BL21(DE3)，得到重组菌株BL21(DE3)/hJ14GH43。本专利技术木糖苷酶HJ14GH43的最适pH为7.0；最适温度为25℃，在0℃、10℃和40℃分别具有14.5％、46.2％和12.8％的酶活；该酶在30％(w/v)的NaCl中仍具有62.0％的活性；但是该酶在5.0–30.0％
(w/v)的NaCl中稳定性很差，经5.0–30.0％(w/v)的NaCl处理1h后，只有大约30％的活性。本专利技术还提供一种具有低温活性的木糖苷酶HJ14GH43在水产饲料及其食品工业中的应用。为了提高所述木糖苷酶HJ14GH43在NaCl中的稳定性，本专利技术通过蛋白质改造技术，将木糖苷酶HJ14GH43的第322位氨基酸由缬氨酸突变为天冬氨酸，获得了该木糖苷酶的突变体V322D。V322D的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示，V322D的基因序列v322d如SEQ ID No.4所示。本专利技术提供了包含上述木糖苷酶突变体基因v322d的重组载体，优选为pEasy-E1-v322d。以表达质粒pEasy-E1-hJ14GH43为模板，通过PCR技术，将hJ14GH43第965位核苷酸T突变为A，得到pEasy-E1-hJ14GH43的突变重组质粒pEasy-E1-v322d。本专利技术还提供了包含上述木糖苷酶突变体基因v322d的重组菌株，优选所述菌株为大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌，优选为重组菌株BL21(DE3)/v322d。本专利技术制备木糖苷酶突变体V322D的方法按以下步骤进行：1)用上述的突变重组质粒转化宿主细胞，得重组菌株；2)培养重组菌株，诱导突变重组木糖苷酶表达；3)回收并纯化所表达的木糖苷酶突变体V322D。其中，优选所述宿主细胞为大肠杆菌细胞，优选将重组大肠杆菌表达质粒转化大肠杆菌细胞BL21(DE3)，得到重组菌株BL21(DE3)/v322d。本专利技术木糖苷酶突变体V322D的最适pH为7.0；最适温度为25℃，在0℃、10℃和40℃分别具有19.1％、48.8％和43.1％的酶活；与HJ14GH43相比，突变体V322D在NaCl中的活性和稳定性都得到了提
高。在20.0–30.0％(w/v)的NaCl中，V322D比HJ14GH43的活性提高约15％；经5.0–30.0％(w/v)的NaCl处理1h后，V322D比HJ14GH43的活性最小提高49％，最大提高113％。本专利技术还提供一种木糖苷酶突变体V322D在水产饲料及其食品工业中的应用。本专利技术的HJ14GH43及其耐盐突变体V322D可应用于食品行业及水产饲料中。突变体V322D比HJ14GH43更适合应用于高盐食品和海产品加工及其它高盐环境生物
附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1：在大肠杆菌中表达的重组木糖苷酶HJ14GH43及其突变体V322D的SDS-PAGE分析，其中，M：蛋白质Marker；W：纯化的重组HJ14GH43；V：纯化的突变体V322D；图2：纯化的重组木糖苷酶HJ14GH43及其突变体V322D水解木二糖(X2)、木三糖(X3)、木四糖(X4)、木五糖(X5)及木六糖(X6)的产物分析，其中，X1：木糖；CK：底物和失活的酶(煮沸10min)；S：反应组；图3：重组木糖苷酶HJ14GH43及其突变体V322D的pH活性；图4：重组木糖苷酶HJ14GH43及其突变体V322D的pH稳定性；图5：重组木糖苷酶HJ14GH43及其突变体V322D的热活性；图6：重组木糖苷酶HJ14GH43及其突变体V322D的热稳定性；图7：重组木糖苷酶HJ14GH43及其突变体V322D在NaCl中的活性；图8：重组木糖苷酶HJ14GH43及其突变体V322D在N本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种具有低温活性的木糖苷酶HJ14GH43，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
【技术特征摘要】
1.一种具有低温活性的木糖苷酶HJ14GH43，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。2.一种编码权利要求1所述的木糖苷酶HJ14GH43的木糖苷酶基因hJ14GH43，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。3.根据权利要求2所述的包含有木糖苷酶基因hJ14GH43的重组载体。4.根据权利要求2所述的包含有木糖苷酶基因hJ14GH43的重组菌，其特征在于，所述重组菌为大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌中的一种。5.根据权利要求1所述具有低温活性的木糖苷酶HJ14GH43在水产饲料及其食品工业中的应用。6.一种耐盐的木糖苷酶突变体V322D，其...
【专利技术属性】
技术研发人员：周峻沛，黄遵锡，张蕊，刘钰，唐湘华，李俊俊，吴倩，慕跃林，
申请(专利权)人：云南师范大学，
类型：发明
国别省市：云南;53
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