本发明专利技术公开了一种荧光定量PCR检测miR‑100含量的引物及检测方法，利用荧光定量PCR检测样品中miR‑100含量，本发明专利技术方法能够快速准确的检测样品中miR‑100的含量，由于胃癌患者的发病都伴随着miR‑100在病变组织以及血清中含量的显著上调，因此，快速有效的miR‑100检测对于胃癌患者的监测是具有重要的意义的。
【技术实现步骤摘要】
(一)
本专利技术涉及miR-100的检测，特别涉及荧光定量PCR检测引物。 (二)
技术介绍
胃癌是一种消化系统常见的恶性肿瘤，发病率高，在我国，致死率居各种恶性肿瘤之首，胃癌标志物的发现及应用对于提高胃癌的早期诊断率有着重大的意义。MicroRNAs(miRNAs)是最近被发现的一类非编码小RNA,研究表明，多数癌症的发生都与miRNA的异常调控有关，miRNA的含量发生了明显的变化，其中，本实验室发现，胃癌患者的发病都伴随着miR-100在病变组织以及血清中含量的显著上调，因此，在胃癌患者的治疗过程中，对miR-100含量的监控变得非常重要，急需建立一种快速准确的miR-100检测方法。(三)
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种荧光定量PCR检测miR-100含量的引物及检测方法。本专利技术采用的技术方案是：本专利技术提供一种荧光定量PCR检测miR-100含量的引物，所述引物包括miR-100反转录引物及miR-100荧光定量PCR引物F和引物R；所述miR-100的核苷酸序列为5’-AACCCGUAGAUCCGAACUUGUG-3’，所述miR-100反转录引物的核苷酸序列为：5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTCACTGGATACGACCACAAGT-3’，所述miR-100荧光定量PCR引物F的核苷酸序列为:5’-CGCCGAACCCGTAGATCCG-3’，所述miR-100荧光定量PCR引物R的核苷酸序列为:5’-TGCAGGGTCCGAGGTCACTG-3’。本专利技术还提供一种利用所述荧光定量PCR检测miR-100含量的引物检测miR-100含量的方法，所述方法为：(1)提取待测样品中的miRNA，利用miRNA反转录试剂(AB公司)及miR-100反转录引物将提取的miRNA通过PCR反应反转录成cDNA；所述反转录PCR的反应程序为：16℃反应30分钟，42℃反应30分钟，最后85℃反应5分钟；(2)以反转录产物cDNA为模板，利用荧光定量PCR试剂(AB公司)及miR-100荧光定量PCR引物进行PCR反应；所述荧光定量PCR的反应程序为：95℃反应10分钟后，进行50个循环的95℃5秒，60℃1分钟。(3)采用绝对定量的方法，将步骤(1)中待测样品改为含miR-100标准品的混合液进行反转录及荧光定量PCR反应，根据含miR-100标准品的混合液中miR-100标准品的浓度对应的起飞CT值，得到miR-100含量与荧光定量PCR反应CT值之间的线性关系，绘制成浓度与CT值之间的标准曲线；根据待测样品CT值，即可检测出miR-100的含量。本专利技术所述待测样品包括：细胞、组织或血清。采用总RNA提取试剂提取待测样品中的miRNA，如果是组织，加入少量液氮研磨后加入Trizol进行裂解，如果是贴壁细胞或者血清，则直接用Trizol进行消化裂解，裂解后，12000rpm离心五分钟，弃沉淀，后加入氯仿震荡混匀静置15分钟，4℃离心15min，取水相至新的离心管中，加入异丙醇混匀，放置5-10分钟，离心，弃上清，RNA即沉于管底，加入50μL的水溶解RNA样品，55-60℃放置5分钟后进行下一步反应。本专利技术的有益效果主要体现在：本方法与现有的检测方法相比，由于 是miR-100含量的特异性检测实验，那么miR-100的特异性反转录与定量PCR的引物最为关键，以前的miRNA的引物全部依赖美国Invitrogen公司的进口，不仅价格昂贵(单对引物价格超2000人民币)，且由于从国外进口，货期长(时间不少于一个月)，因此进行miRNA含量的检测十分的不便，本专利技术针对该实验最为关键的miR-100的特异性反转录与定量PCR的引物入手，经过对miRNA茎环结构的实验及分析，成功的得到了miR-100的特异性反转录与定量PCR的引物序列，后续实验验证了该引物的可靠性，且货期短(国内合成1到2天)，价格便宜(几十人民币)，该专利技术为miRNA的研究提供了便利。本专利技术提供一种荧光定量PCR检测miR-100含量的引物，利用荧光定量PCR检测样品中miR-100含量，本专利技术方法能够快速准确的检测样品中miR-100的含量，由于胃癌患者的发病都伴随着miR-100在病变组织以及血清中含量的显著上调，因此，快速有效的miR-100检测对于胃癌患者的监测是具有重要的意义的。(四)附图说明图1为筛选验证miR-100引物是否可用的定量PCR溶解曲线。图2为标准曲线。图3利用本专利技术引物检测胃癌组织与正常组织中miR-100含量的结果图。图4利用本专利技术引物检测胃癌患者血清与正常血清中miR-100含量的结果图。图5为miRNA茎环。(五)具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术进行进一步描述，但本专利技术的保护范围并不仅限于此：实施例1：根据实验室对miRNA茎环(图5)的测序，结合miRNA的转录机制，设计出了miRNA的反转录及定量PCR引物。反转录引物： GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTCACTGGATACGACXXXXXXXXXXXXXX表示将miR-100成熟序列最后7个碱基反向互补得到的序列。定量PCR正向引物：CGCCGXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX表示miR-100成熟序列的前13个碱基序列。 定量PCR反向引物：TGCAGGGTCCGAGGTCACTG利用该引物设计规则，可以设计出任何一条miRNA的引物。miR-100引物的验证 (1)将miR-100标准品用DEPC水配制成10-3、10-2、10-1、100、101、102、103μM的mi-100标准品溶液，利用miRNA反转录试剂(AB公司)及miR-100反转录引物将提取的miRNA通过PCR反应反转录成cDNA；所述反转录PCR的反应程序为：16℃反应30分钟，42℃反应30分钟，最后85℃反应5分钟；(2)以反转录产物cDNA为模板，利用荧光定量PCR试剂(AB公司)及miR-100荧光定量PCR引物进行PCR反应；所述荧光定量PCR的反应程序为：95℃反应10分钟后，进行50个循环的95℃5秒，60℃1分钟。结果见图1所示，PCR溶解曲线很单一，说明引物特异性好，可以有效的检测miR-100含量。实施例2标准曲线(1)将miR-100标准品用DEPC水配制成10-3、10-2、10-1、100、101、102、103μM的mi-100标准品溶液，利用miRNA反转录试剂(AB公司)及miR-100反转录引物将提取的miRNA通过PCR反应反转录成cDNA；所述反转录PCR的反应程序为：16℃反应30分钟，42℃反应30分钟，最后85℃反应5分钟；(2)以反转录产物cDNA为模板，利用荧光定量PCR试剂(AB公司)及miR-100荧光定量PCR引物进行PCR反应；所述荧光定量PCR的反应程序为：95℃反应10分钟后，进行50个循环的95℃5秒，60℃1分钟。根据含miR-100标准品溶液中miR-100标准品的浓度对应的起飞CT值，得到miR-100含量与荧光定量PCR反应CT值之间的线性关系，绘制成浓度与CT值之间的标准曲线，结果见图2所示。CT＝3.259×lgx+33.7本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种荧光定量PCR检测miR‑100含量的引物，其特征在于所述引物包括miR‑100反转录引物及miR‑100荧光定量PCR引物F和引物R；所述miR‑100的核苷酸序列为5’‑AACCCGUAGAUCCGAACUUGUG‑3’，所述miR‑100反转录引物的核苷酸序列为：5’‑GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTCACTGGATACGACCACAAGT‑3’，所述miR‑100荧光定量PCR引物F的核苷酸序列为:5’‑CGCCGAACCCGTAGATCCG‑3’，所述miR‑100荧光定量PCR引物R的核苷酸序列为:5’‑TGCAGGGTCCGAGGTCACTG‑3’。
【技术特征摘要】
1.一种荧光定量PCR检测miR-100含量的引物，其特征在于所述引物包括miR-100反转录引物及miR-100荧光定量PCR引物F和引物R；所述miR-100的核苷酸序列为5’-AACCCGUAGAUCCGAACUUGUG-3’，所述miR-100反转录引物的核苷酸序列为：5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTCACTGGATACGACCACAAGT-3’，所述miR-100荧光定量PCR引物F的核苷酸序列为:5’-CGCCGAACCCGTAGATCCG-3’，所述miR-100荧光定量PCR引物R的核苷酸序列为:5’-TGCAGGGTCCGAGGTCACTG-3’。2.一种利用权利要求1所述荧光定量PCR检测miR-100含量的引物检测miR-100含量的方法，其特征在于所述方法为：(1)提取待测样品中的miRNA，利用miRNA反转录试剂及miR-1...
【专利技术属性】
技术研发人员：章晓波，龚燚，杨耿，王雨濛，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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