一种快速准确鉴定评价黑木耳种质资源的方法及黑29品种特异性分子身份证技术

本发明专利技术公开了一种快速准确鉴定评价黑木耳种质资源的方法及黑29品种特异性分子身份证，通过SSR分子标记对黑木耳品种进行研究，采用资源特征分析软件分析研究结果，将研究结果量化，得出字符串形式的结果，构建黑木耳品种分子身份证特异性指纹图谱。分子身份证把品种特征数字化，这样可简单明了地区分不同黑木耳品种间的差异，这种分子身份证可用于黑木耳品种的真伪鉴定和遗传关系分析，为黑木耳品种的知识产权保护提供了有效的科学依据。在黑木耳品种鉴定评价时，只需将黑木耳品种与已有特异性分子身份证比较分析，即可确定其是否为已通过审定的黑木耳品种。这大大降低了黑木耳种质资源鉴定评价的时间和费用，提高了黑木耳品种鉴定评价的效率。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种黑木耳种质资源评价鉴定方法及按照该方法构建的黑29品种特异性分子身份证。
技术介绍
黑龙江省作为黑木耳主产区，黑木耳产量居全国首位，据中国食用菌协会统计，2014年黑龙江省黑木耳种植63.5亿袋，总产量316.44万吨，产值166.7亿元。黑龙江省气温低、昼夜温差大、日照时间长等独特的气候特点使生产的黑木耳色黑肉厚，品质好。随着黑龙江省黑木耳产业的发展，对于黑木耳菌种的需求越来越大。但是，市场对于黑木耳品种管理混乱，不同菌种生产企业之间相互引种频繁并自主命名，导致黑木耳菌种市场“同物异名、同名异物”现象普遍存在，这给黑木耳品种的知识产权保护、菌种质量管理和新品种审定带来了很大的困难。为了保护优良的黑木耳种质资源，需要对黑木耳品种进行科学鉴定和评价。但目前缺乏简洁高效的菌种检测手段，因此迫切需要研制一种简便、快速、准确的菌种鉴定评价技术及标准方法，以保证生产用种的准确无误。黑龙江省从2008年开始实施黑木耳品种的审定，黑木耳审定品种的区别性鉴定工作主要通过农艺性状、RAPD和ISSR方法进行评价鉴定。农艺性状主要根据表型分析的DUS(Distinctness，Uniformity和Stability)测试来鉴定，但是，由于黑木耳子实体形态结构简单，在不同的栽培模式、不同的管理方式下，黑木耳子实体的形态、色泽、产量存在较大差异，且部分性状的鉴定易受人为因素影响。分子标记方法克服了农艺性状受人为因素的影响，但是RAPD为单引物分子标
记，扩增结果不够稳定，重复性较差。ISSR也是单引物分子标记，虽然提高了退火温度，克服了RAPD的不足，但是在黑木耳品种评价鉴定时，结果易受到操作批次的影响，结果的重复性较差。采用成对引物的SRAP和TRAP分子标记重复性较好，但是针对食用菌类种质使用此方法时，遗传多样性较低，需要大量引物对才能有效区分，工作量大且繁琐。而且，在进行新品种的鉴定评价时，每当有新品种需要鉴定评价时，都需要对已鉴定评价的品种再次进行分析，工作量大，不利于新品种的快速准确鉴定评价。简单重复序列(SSR)是以2～6个碱基为重复单元的串联重复序列，广泛存在于高等生物的基因组中。SSR分子标记符合品种鉴别的基本准则，即环境稳定性、品种间变异可识别性、最小的品种内变异和实验结果可靠性。因此，SSR分子标记在黑木耳品种鉴定评价中具有良好的应用前景。
技术实现思路
本专利技术的目的在于通过SSR分子标记对黑木耳品种进行研究，建立一种快速准确鉴定评价黑木耳种质资源的方法及黑29品种特异性分子身份证，采用资源特征分析软件分析研究结果，将研究结果量化，得出字符串形式的结果，构建黑木耳品种分子身份证特异性指纹图谱。特异性分子身份证把品种特征数字化，这样可以简单明了地区分不同黑木耳品种间的差异，这种特异性分子身份证可用于黑木耳品种的真伪鉴定和遗传关系分析，为黑木耳品种的知识产权保护提供了有效的科学依据。而且，在黑木耳品种鉴定评价时，只需要以待检测黑木耳品种为实验材料，按照黑木耳种质资源鉴定评价方法操作，通过与已有特异性分子身份证的比较分析，即可确定其是否为已通过审定的黑木耳品种。这大大降低了黑木耳种质资源鉴定评价的时间和费用，提高了黑木耳品种鉴定评价的效率，且精确度较高。本专利技术的目的是通过以下技术方案实现的：一种快速准确鉴定评价黑木耳种质资源的方法，包括如下步骤：(1)母种活化将母种从保藏状态恢复到室温状态，将母种转接到cPDA固体培养皿中央，25℃恒温避光培养8d活化备用。(2)液体培养接种时用0.5cm打孔器在相同菌龄处打孔，接种锥形瓶中，每瓶锥形瓶中装有液体PD培养基200mL，每个锥形瓶接种10个接种块，120r/min，25℃恒温避光培养10d。(3)菌丝收集液体摇瓶菌丝体用四层纱布过滤，过滤后的菌丝体用蒸馏水冲洗表面杂质，收集的菌丝体于-20℃保存备用。(4)总DNA提取采用植物基因组DNA提取试剂盒提取总DNA。(5)总DNA质量检测采用DYY-12型电泳仪用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测。采用UV757CRT紫外分光光度计检测总DNA浓度，测定A260值和A280值，要求A280/A260为1.8至2.0时可用于后续试验操作，样品稀释到50mg/μL，-20℃保存备用。(6)SSR引物SSR引物如表1所示。表1SSR引物表(7)SSR扩增扩增体系：2.0μL 10×Ex Taq Buffer(Takara)，2.0μL dNTP(0.2mmol/L)，1.0μL上游引物(0.5μmol/L)，1.0μL下游引物(0.5μmol/L)，0.5U DNA聚合酶(Takara)，1.0μL模板DNA(50ng/μL)，ddH2O补至20μL。扩增程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，54～60℃复性30s，72℃延伸2min，35个循环；72℃延伸7min，退火温度如表1所示。电泳成像：采用BIO-RAD凝胶成像系统拍照并记录电泳结果。(8)数据统计分析对SSR扩增产物的电泳结果进行人工比对、校正，有条带记为1，无条带记为0，构建初始0、1数据矩阵。(9)资源特征分析软件分析采用资源特征分析软件ID Analysis软件按照SSR引物编号顺序，构建黑木耳种质资源的特异性分子身份证。(10)黑木耳品种鉴定评价当黑木耳品种需要鉴定评价时，以待检测黑木耳品种为实验材料，执行步骤(1)-(9)，通过与已有特异性分子身份证比较分析，即可确定其是否为已通过审定的黑木耳品种。一种黑29品种特异性分子身份证，其构建方法如下：(1)母种活化将黑29母种从保藏状态恢复到室温状态，将母种转接到cPDA固体培养皿中央，25℃恒温避光培养8d活化备用。(2)液体培养接种时用0.5cm打孔器在相同菌龄处打孔，接种锥形瓶中，每瓶锥形瓶中装有液体PD培养基200mL，每个锥形瓶接种10个接种块，120r/min，25℃恒温避光培养10d。(3)菌丝收集液体摇瓶菌丝体用四层纱布过滤，过滤后的菌丝体用蒸馏水冲洗表面杂质，收集的菌丝体于-20℃保存备用。(4)总DNA提取采用植物基因组DNA提取试剂盒提取总DNA。(5)总DNA质量检测采用DYY-12型电泳仪用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测。采用UV757CRT紫外分光光度计检测总DNA浓度，测定A260值和A280值，要求A280/A260为1.8至2.0时可用于后续试验操作，样品稀释到50mg/μL，-20℃保存备用。(6)SSR引物SSR引物如表1所示。(7)SSR扩增扩增体系：2.0μL 10×Ex Taq Buffer(Takara)，2.0μL dNTP(0.2mmol/L)，1.0μL上游引物(0.5μmol/L)，1.0μL下游引物(0.5μmol/L)，0.5U DNA聚合酶(Takara)，1.0μL模板DNA(50ng/μL)，ddH2O补至20μL。扩增程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，54～60℃复性30s，72℃延伸2min，35个循环；72℃延伸7min，退火温度如表1所示。电泳成像：采用BIO-RAD凝胶成像系统拍照并记录电泳结果。(8)数据统计分析对SSR扩增产物的电泳结果进行人工比对、校正，有本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种快速准确鉴定评价黑木耳种质资源的方法，其特征在于所述方法步骤如下：(1)母种活化将母种从保藏状态恢复到室温状态，将母种转接到cPDA固体培养皿中央，25℃恒温避光培养8d活化备用；(2)液体培养接种时用0.5cm打孔器在相同菌龄处打孔，接种锥形瓶中，每瓶锥形瓶中装有液体PD培养基200mL，每个锥形瓶接种10个接种块，120r/min，25℃恒温避光培养10d；(3)菌丝收集液体摇瓶菌丝体用四层纱布过滤，过滤后的菌丝体用蒸馏水冲洗表面杂质，收集的菌丝体于‑20℃保存备用；(4)总DNA提取采用植物基因组DNA提取试剂盒提取总DNA；(5)总DNA质量检测采用DYY‑12型电泳仪用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测；采用UV757CRT紫外分光光度计检测总DNA浓度，测定A260值和A280值，样品稀释到50mg/μL，‑20℃保存备用；(6)SSR引物SSR引物如表1所示：表1 SSR引物表(7)SSR扩增扩增体系：2.0μL 10×Ex Taq Buffer，2.0μL 0.2mmol/L dNTP，1.0μL 0.5μmol/L上游引物，1.0μL 0.5μmol/L游引物，0.5U DNA聚合酶，1.0μL 50ng/μL模板DNA，ddH2O补至20μL；扩增程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，54～60℃复性30s，72℃延伸2min，35个循环；72℃延伸7min，退火温度如表1所示；电泳成像：采用BIO‑RAD凝胶成像系统拍照并记录电泳结果；(8)数据统计分析对SSR扩增产物的电泳结果进行人工比对、校正，有条带记为1，无条带记为0，构建初始0、1数据矩阵；(9)资源特征分析软件分析采用资源特征分析软件ID Analysis软件按照SSR引物编号顺序，构建黑木耳种质资源的特异性分子身份证；(10)新品种鉴定评价当黑木耳品种需要鉴定评价时，以待检测黑木耳品种为实验材料，执行步骤(1)‑(9)，通过与已有特异性分子身份证比较分析，即可确定其是否为已通过审定的黑木耳品种。...

【技术特征摘要】
1.一种快速准确鉴定评价黑木耳种质资源的方法，其特征在于所述方法步骤如下：(1)母种活化将母种从保藏状态恢复到室温状态，将母种转接到cPDA固体培养皿中央，25℃恒温避光培养8d活化备用；(2)液体培养接种时用0.5cm打孔器在相同菌龄处打孔，接种锥形瓶中，每瓶锥形瓶中装有液体PD培养基200mL，每个锥形瓶接种10个接种块，120r/min，25℃恒温避光培养10d；(3)菌丝收集液体摇瓶菌丝体用四层纱布过滤，过滤后的菌丝体用蒸馏水冲洗表面杂质，收集的菌丝体于-20℃保存备用；(4)总DNA提取采用植物基因组DNA提取试剂盒提取总DNA；(5)总DNA质量检测采用DYY-12型电泳仪用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测；采用UV757CRT紫外分光光度计检测总DNA浓度，测定A260值和A280值，样品稀释到50mg/μL，-20℃保存备用；(6)SSR引物SSR引物如表1所示：表1 SSR引物表(7)SSR扩增扩增体系：2.0μL 10×Ex Taq Buffer，2.0μL 0.2mmol/L dNTP，1.0μL 0.5μmol/L上游引物，1.0μL 0.5μmol/L游引物，0.5U DNA聚合酶，1.0μL 50ng/μL模板DNA，ddH2O补至20μL；扩增程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，54～60℃复性30s，72℃延伸2min，35个循环；72℃延伸7min，退火温度如表1所示；电泳成像：采用BIO-RAD凝胶成像系统拍照并记录电泳结果；(8)数据统计分析对SSR扩增产物的电泳结果进行人工比对、校正，有条带记为1，无条带记为0，构建初始0、1数据矩阵；(9)资源特征分析软件分析采用资源特征分析软件ID Analysis软件按照SSR引物编号顺序，构建黑木耳种质资源的特异性分子身份证；(10)新品种鉴定评价当黑木耳品种需要鉴定评价时，以待检测黑木耳品种为实验材料，执行步骤(1)-(9)，通过与已有特异性分子身份证比较分析，即可确定其是否为已通过审定的黑木耳品种。2.根据权利要求1所述的快速准确鉴定评价黑木耳种质资源的方法，其特征在于所述A280/A260为1.8至2.0。3.根据权利要求1所述的快速准确鉴定评价黑木耳种质资源的
\t方法，其特征在于构建黑木耳种质资源的特异性分子身份证所用试验材料为黑29、黑威15号、黑威单片、黑威10号、黑威981、S1、林科3号和宏大2009。4.一种黑29品种特异性分子身份证，其特征在于所述黑29品种特异性分子身份证按照如下方法构建：(1)母种活化将黑29母种从保藏状态恢复到室温状态，将母种转接到cPDA固体培养皿中央，25℃恒温避光培养8d活化备用；(2)液体培养接种时用0.5cm打孔器在相同菌龄处打孔，接种锥形瓶中，每瓶锥形瓶中装有液体PD培养基200...

【专利技术属性】
技术研发人员：马银鹏，张介驰，张丕奇，戴肖东，孔祥辉，马庆芳，韩增华，刘佳宁，陈鹤，王玉文，
申请(专利权)人：黑龙江省科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：黑龙江;23