本发明专利技术一株产菊粉酶的菌株，其分类命名为草酸青霉(Penicillum oxalicum)，菌株号为XL01，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2016355，保藏日期为2016年6月28日。以此青霉菌为发酵菌株，以菊粉为碳源、牛肉膏为氮源等组成发酵培养基发酵生产菊粉酶。发酵后经检测，该酶同时具有菊粉酶活性和转化酶活性，酶活最高可达到46.2IU/mL，33.6IU/mL。将菊粉酶添加到60‑120g/L菊粉溶液中发酵法制备D‑乳酸。实验结果表明同步糖化发酵乳酸得率远高于分步糖化发酵，发酵72h，D‑乳酸得率高达97.9‑100％。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种生产菊粉酶的菌株，以及该菌株发酵生产的菊粉酶粗酶液转化菊粉发酵制备D-乳酸的方法，属于生物化工
技术介绍
近年来由于土壤盐碱化、土地荒漠化程度不断加深，如何利用大面积盐碱地发展农业已经成为目前亟待解决的重大课题。因此，如何选育耐盐性植物广受科学界的重视。菊芋、菊苣等植物抗逆性强，抗寒，抗盐碱，抗风沙，再生能力极强。种植这些植物不仅不占用耕地，还能使我国数千万亩滩涂地和盐碱地得到开发利用，有利于环境保护。将菊芋等植物经过简单去皮、切片、烘干、打粉获得菊粉。菊粉是一种储存性多糖，因而研究菊粉的生物炼制，制备经济附加值更高的化学品前景非常广阔。菊粉很容易被菊粉酶水解成果糖和葡萄糖，菊粉酶属于水解酶类，一般微生物来源的菊粉酶同时具有菊粉酶活性(Inulinase,I)和转化酶活性(Sucrase,S)。产菊粉酶的菌株包括丝状真菌、酵母和细菌，其中研究较多的是曲霉属(Aspegillius sp.)、青霉属(Penicillium sp.)和克鲁维酵母属(Kluyveromyces sp.)。目前报道来看，酵母来源的菊粉酶转化酶活性要高于霉菌来源的转化酶活性。本专利技术围绕生物催化转化制备D-乳酸，筛选到一株产菊粉酶的微生物，证明了此酶可以同步糖化发酵较高浓度菊粉得到高得率D-乳酸，具有潜在工业价值。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种新的微生物，它能够生产高酶活的菊粉酶。本专利技术的另一个目的是提供该菊粉酶应用于D-乳酸生产的方法。为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案如下：一株产菊粉酶的菌株，其分类命名为草酸青霉(Penicillum oxalicum)，菌株号为XL01，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址：中国.武汉.武汉大学，邮编430072，保藏编号为CCTCC NO：M 2016355，保藏日期为2016年6月28日。该菌株是专利技术人于2015年1月从来源于江苏的菊芋生长处土壤中筛选得到的，该酶同时具有较高的菊
粉酶活性和转化酶活性。本专利技术所述草酸青霉为圆形，凸起，质地疏松，外观干燥不透明，呈绒毛状，直径1-3厘米的菌落。菌落正面呈青绿色背面呈棕黄色。菌株液体培养时菌丝球均匀悬浮于培养液。对该菌株DNA提取及18srRNA基因PCR扩增，进行测序分析，如SEQIDNo：1所示，结果显示该菌株为草酸青霉(Penicillum oxalicum)。上述产菊粉酶的菌株在生产菊粉酶中的应用也在本专利技术的保护范围之内。具体的生产方法包括如下步骤：(1)种子培养草酸青霉(Penicillum oxalicum)于24-36℃(优选30℃)条件下在种子培养基中培养16-26h(优选20h)活化该菌株；(2)发酵培养将步骤(1)得到的种子液，以0.5％-3.5％(v/v)(优选2％v/v)接种量接种到发酵培养基中，在24-36℃发酵3-9天(优选7天)生产菊粉酶。步骤(1)中，所述的种子培养基配方如下：蛋白胨2-8g/L，牛肉膏2-8g/L，葡萄糖5-10g/L，氯化钠2-5g/L，溶剂为水；优选的配方如下：蛋白胨5g/L，牛肉膏3g/L，葡萄糖5g/L，氯化钠5g/L，溶剂为水。步骤(2)中，所述的发酵培养基配方如下：菊粉10-30g/L，牛肉膏10-30g/L，硫酸铵5g/L，氯化钠5g/L，七水合硫酸镁0.5g/L，溶剂为水，pH 3-7。将步骤(2)得到的发酵液经离心收集上清液即为粗酶液，经检测该酶同时具有菊粉酶活性和转化酶活性，酶活最高可达到46.2IU/mL(I，菊粉酶活力)，33.6IU/mL(S，转化酶活力)。本专利技术方法制备得到的菊粉酶最适反应温度为65℃，但在此高温下酶易失活。50℃时，菊粉酶活力较高，同时酶活稳定性较高，48h仍有86％左右菊粉酶活和转化酶活。本专利技术方法制备得到的菊粉酶最适反应pH为5，同时在此pH条件下保温2h剩余92％酶活。上述产菊粉酶的菌株在转化菊粉制备D-乳酸中的应用也在本专利技术的保护范围之内。具体的转化菊粉制备D-乳酸的方法包括如下步骤：(1)草酸青霉(Penicillum oxalicum)发酵生产菊粉酶；(2)向菊粉水溶液中添加乳酸菌和菊粉酶同步糖化发酵制备D-乳酸。步骤(1)的方法同上。步骤(2)中，菊粉水溶液中，菊粉的浓度为60-120g/L。步骤(2)中，菊粉酶酶用量以转化酶活力计为30IU/g菊粉；乳酸菌接种量10％(优选德氏乳杆菌亚种保加利亚乳杆菌Lactobacillus bulgaricus CGMCC 1.6970)其中，菊粉酶的定义如下：一个菊粉酶活力(I)单位定义为1min催化菊粉转化为1μmol果糖所需的酶量，一个转化酶活力(S)单位定义为1min催化1μmol蔗糖所需的酶量。步骤(2)中，发酵条件为：反应温度37-47℃(优选42℃)，pH4.8-6.0(优选pH5.2)，反应48-72h；发酵前或者发酵过程中添加2/3菊粉重量的CaCO3作为中和剂。本专利技术的有益效果是：本专利技术涉及一株从土壤中筛选而来的草酸青霉菌株，以此青霉菌为发酵菌株，以菊粉为碳源、牛肉膏为氮源等组成发酵培养基，在30℃，pH 5，接种量2％(v/v)，转速220rpm，发酵生产菊粉酶。发酵后经检测，该酶同时具有菊粉酶活性和转化酶活性，酶活最高可达到46.2IU/mL(I)，33.6IU/mL(S)。将菊粉酶添加到60-120g/L菊粉溶液中转化菊粉制备D-乳酸，发酵72h，得率为97.9％-100％。本专利技术方法利用草酸青霉生产菊粉酶，并将该酶应用于D-乳酸生产上，具有转化率高、产量高等特点，在制备乳酸化学品上具有很大的应用前景。附图说明图1为实施例5中菊粉在菊粉酶粗酶液催化下转化为单糖和低聚果糖的高效阴离子交换色谱图。图2为实施例3中菊粉酶温度稳定性。具体实施方式以下结合应用实施例对本专利技术作进一步的阐述。实施实例是为说明而非限制本专利技术。本领域中任何普通技术人员能够理解这些实施实例不以任何方式限制本专利技术，可做适当的修改而不违背本专利技术的实质和偏离本专利技术的范围。实施例1：一种产菊粉酶菌株的筛选和鉴定(1)初筛取菊芋生长处的土壤和菊芋堆放处的土壤，于含有无菌水和玻璃珠的锥形瓶中，稀释一定倍数涂布在以菊粉为唯一碳源的培养基上，30℃，培养3-7d，筛选出能利用菊粉的菌株50株。(2)复筛选取培养基上的单菌落接种于发酵培养基中，30℃，200rpm摇瓶发酵3天测定菊粉酶活性，选出其中发酵性能最优的一株菌。(3)鉴定对该菌株DNA提取及18srRNA基因PCR扩增，进行测序分析，如SEQIDNo：1所示，结果显示该菌株为草酸青霉。在上述实验中，初筛培养基为：菊粉20g/L，硝酸钠2g/L，七水合硫酸镁1g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，七水合硫酸亚铁0.01g/L，琼脂20g/L。复筛活化培养基为：蛋白胨5g/L，牛肉膏3g/L，葡萄糖5g/L，氯化钠5g/L。发酵培养基为：菊粉20g/L，牛肉膏20g/L，硫酸铵5g/L，氯化钠5g/L，七水合硫酸镁0.5g/L。实施例2：PenicillumoxalicumXL01发酵产菊粉酶用Penicillumoxalicu本文档来自技高网...
【技术保护点】
一株产菊粉酶的菌株，其分类命名为草酸青霉(Penicillum oxalicum)，菌株号为XL01，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2016355，保藏日期为2016年6月28日。
【技术特征摘要】
1.一株产菊粉酶的菌株，其分类命名为草酸青霉(Penicillum oxalicum)，菌株号为XL01，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2016355，保藏日期为2016年6月28日。2.权利要求1所述的产菊粉酶的菌株在生产菊粉酶中的应用。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，生产方法包括如下步骤：(1)种子培养草酸青霉(Penicillum oxalicum)于24-36℃条件下在种子培养基中培养16-26h活化该菌株；(2)发酵培养将步骤(1)得到的种子液，以0.5％-3.5％(v/v)接种量接种到发酵培养基中，在24-36℃，转速160-240rpm发酵3-9天生产菊粉酶。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤(1)中，所述的种子培养基配方如下：蛋白胨2-8g/L，牛肉膏2-8g/L，葡萄糖5-10g/L，氯化钠2-5g/L，溶剂为水。5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤(2)中，所述...
【专利技术属性】
技术研发人员：欧阳嘉，许茜茜，刘鹏，郑兆娟，勇强，
申请(专利权)人：南京林业大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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