一种选择性分离培养广泛耐药铜绿假单胞菌的培养基及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种选择性分离培养广泛耐药铜绿假单胞菌的培养基及其制备方法，在NAC基础培养基中添加了处于对数生长期的铜绿假单胞菌的培养上清液和抗生素组合。所述培养上清液中含有铜绿假单胞菌分泌的群体感应物质，能加快细菌的生长并促进铜绿色素的分泌，大大缩短了检测时间；所述抗生素组合包括碳青霉烯类抗生素、氨基糖苷类抗生素和喹诺酮类抗生素，各抗生素的添加量均为0.016g/L，能特异性抑制敏感铜绿假单胞菌株和单一药物耐药铜绿假单胞菌株的生长，达到选择性分离培养广泛耐药铜绿假单胞菌的目的，特异性强，灵敏度高。而且，这种培养基能长时间保存，能有效应用于临床样本中广泛耐药铜绿假单胞菌的快速检测。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于病原微生物学领域，具体涉及一种选择性分离培养广泛耐药铜绿假单胞菌的培养基及其制备方法。
技术介绍
铜绿假单胞菌是一种常见的条件致病菌，能引起化脓性病变，感染后因脓汁和渗出液呈绿色，故又名绿脓杆菌，是临床上重要的条件致病菌之一。铜绿假单胞菌感染可发生在人体任何部位和组织、常见于烧伤或创伤部位、中耳、角膜、尿道和呼吸道，也可引起心内膜炎、胃肠炎、脓胸甚至败血症，甚至导致严重的呼吸道感染，如肺部慢性纤维化患者的感染。由于耐药性强和生物被膜的形成，铜绿假单胞菌感染很难治愈。在临床样本检验中，常常通过使用血液琼脂培养基培养从检测样本中的众多菌落中挑取高度怀疑的菌落进行分离培养，并在确认所培养聚落无杂菌污染后，再对该培养菌落进行系统鉴定和药物敏感性实验。该传统检测方法检测时间常常达72小时或以上，耗时较长。目前认为使用NAC琼脂培养基能够大大缩短检测时间的常用培养基，但该培养基配方中含有能影响铜绿假单胞菌生长速度的奈叮酸抗生素，使得该检测方法也需48小时。另外，上述检测方法往往只能从几百或上千菌落中挑选出1～3个菌落进行药物敏感性试验，容易漏检耐药菌株，灵敏度较低。细菌产生自诱导物质(autoinducers，AIs)作为细菌间相互联系的信号分子，其浓度随着细菌的增殖而升高。由于该信号分子能自由通过细胞膜，因此细胞内外的浓度相近。当该信号分子浓度达到一定范围，能激活细菌胞内的受体，从而改变基因表达，调控细菌的生物行为，如产生毒素、形成生物膜、生成孢子和产生荧光等，这种现象就是群体感应(quorum sensing，QS)。目前研究较多的革兰阴性菌的群体感应物质为N-酰基高丝氨酸内酯(N-acylhomoserine lactones，AHLs)，能促进铜绿假单胞菌分泌绿脓菌素时间提前，但是由于该类群体感应物质分子量及其相近，分离纯化难度大，纯化成本较高。另外，细菌的群体感应物质是极为复杂的，人为地往培养基中添加一种单一物质，在不同条件下效果会不一样。
技术实现思路
为克服上述技术缺陷，本专利技术的目的在于提供了一种选择性分离培养广泛耐药铜绿假单胞菌的培养基及其制备方法，能有效缩短检测时间，并具有灵敏度高以及操作简便的特点。为实现上述目的，本专利技术提供的一种选择性分离培养广泛耐药铜绿假单胞菌的培养基，包括NAC基础培养基、培养上清液、蒸馏水和抗生素组合；所述培养上清液为处于对数生长期的广泛耐药铜绿假单胞菌的培养上清液；所述培养上清液与蒸馏水的体积比为1:19～1:4；所述抗生素组合中的各抗生素的添加量均为0.016g/L。优选的，所述NAC基础培养基的配方为蛋白胨20g/L、磷酸氢二钾0.3g/L、硫酸镁0.2g/L、溴棕三甲铵0.2g/L、萘啶酸0.015g/L和琼脂15g/L。优选的，所述上清液中含有铜绿假单胞菌分泌的群体感应物质，所述群体感应物质为N-酰基高丝氨酸内酯。优选的，所述抗生素组合包括碳青霉烯类抗生素、氨基糖苷类抗生素和喹诺酮类抗生素。优选的，所述碳青霉烯类抗生素为亚胺培南，所述氨基糖苷类抗生素为阿卡米星，所述喹诺酮类抗生素为环丙沙星。优选的，所述培养上清液与所述蒸馏水的体积比为1:9。本专利技术还提供了上述培养基的制备方法，该方法包括如下步骤：(1)采用脑心浸液肉汤(BHI)液体培养基接种培养铜绿假单胞菌至对数生长期，离心，取上清液，并使用直径为0.22μm的灭菌灭菌过滤器过滤灭菌，获得培养上清液；(2)按NAC基础培养基配方称取蛋白胨20g/L、磷酸氢二钾0.3g/L、硫酸镁0.2g/L、溴棕三甲铵0.2g/L、萘啶酸0.015g/L和琼脂15g/L，加入步骤(1)获得的培养上清液和蒸馏水，混匀，121℃高压灭菌25min；所述培养上清液与蒸馏水的体积比为1:19～1:4；(3)灭菌后放置室温冷却至60℃后分别添加抗生素组合，混匀，室温冷却。优选的，所述步骤(2)中所述培养上清液与所述蒸馏水的体积比为1:9。优选的，所述步骤(3)中所述抗生素组合包括碳青霉烯类抗生素、氨基糖苷类抗生素和喹诺酮类抗生素，所述碳青霉烯类抗生素为亚胺培南，所述氨基糖苷类抗生素为阿卡米星，所述喹诺酮类抗生素为环丙沙星。优选的，所述亚胺培南、所述阿卡米星和所述环丙沙星的添加量均为0.016g/L。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：(1)本专利技术培养基利用了培养上清液中的群体感应物质，可促进铜绿色素的分泌，缩短检测时间。(2)本专利技术培养基包括抗生素组合，能特异性抑制敏感铜绿假单胞菌株和单一药物耐药铜绿假单胞菌株的生长，达到选择性分离培养广泛耐药铜绿假单胞菌的目的，特异性强，灵敏度高。具体实施方式为使本专利技术更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按照常规实验方法进行。实施例1：添加铜绿假单胞菌培养上清液的NAC培养基与添加N-酰基高丝氨酸内酯的NAC培养基的效果比较往NAC培养基中添加铜绿假单胞菌培养上清液所制备得到的培养基是本专利技术培养基的一个优选实施例，以下是本优选实施例的具体实验步骤：1、NAC培养基的制备称量蛋白胨20g、磷酸氢二钾0.3g、硫酸镁0.2g、溴棕三甲铵0.2g、萘啶酸0.015g、琼脂15g，并溶于1L蒸馏水中，混匀，于121℃高压灭菌25min后浇注到无菌平板上，室温冷却，获得NAC培养基琼脂平板，设为对照组1。2、添加N-酰基高丝氨酸内酯的NAC培养基的制备称量蛋白胨20g、磷酸氢二钾0.3g、硫酸镁0.2g、溴棕三甲铵0.2g、萘啶酸0.015g、琼脂15g，加入10mmol的N-酰基高丝氨酸内酯(Sigma-Aldrich)和1L蒸馏水，混匀，121℃高压灭菌25min后浇注到无菌平板上，室温冷却，获得添加N-高丝氨酸内酯的NAC培养基琼脂平板，设为对照组2。3、添加不同比例的铜绿假单胞菌培养上清液的NAC培养基的制备(1)采用脑心浸液肉汤(BHI)液体培养基接种培养铜绿假单胞菌(ATCC27853株)至对数生长期，10000g离心5分钟，取上清液，并使用直径为0.22μm的灭菌过滤器过滤灭菌，获得培养上清液。(2)称量蛋白胨20g、磷酸氢二钾0.3g、硫酸镁0.2g、溴棕三甲铵0.2g、萘啶酸0.015g、琼脂15g，加入50mL铜绿假单胞菌的培养上清液和950mL蒸馏水，混匀，121℃高压灭菌25min后浇注到无菌平板上，室温冷却，获得铜绿假单胞菌培养上清液和蒸馏水体积比为1:19的NAC培养基琼脂平板A，设为实验组1。(3)称量蛋白胨20g、磷酸氢二钾0.3g、硫酸镁0.2g、溴棕三甲铵0.2g、萘啶酸0.015g、琼脂15g，加入100mL铜绿假单胞菌的培养上清液和900mL蒸馏水，混匀，121℃高压灭菌25min后浇注到无菌平板上，室温冷却，获得铜绿假单胞菌培养上清液和蒸馏水体积比为1:9的NAC培养基琼脂平板B，设为实验组2。(4)称量蛋白胨20g、磷酸氢二钾0.3g、硫酸镁0.2g、溴棕三甲铵0.2g、萘啶酸0.015g、琼脂15g，加入200mL铜绿假单胞菌的培养上清液和800mL蒸馏水，混匀，121℃高压灭菌25min后浇注到无菌平本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种选择性分离培养广泛耐药铜绿假单胞菌的培养基，其特征在于，所述培养基包括NAC基础培养基、培养上清液、蒸馏水和抗生素组合；所述培养上清液为处于对数生长期的广泛耐药铜绿假单胞菌的培养上清液；所述培养上清液与所述蒸馏水的体积比为1:19～1:4；所述抗生素组合中的各抗生素的添加量均为0.016g/L。

【技术特征摘要】
2016.06.09 CN 20161040746051.一种选择性分离培养广泛耐药铜绿假单胞菌的培养基，其特征在于，所述培养基包括NAC基础培养基、培养上清液、蒸馏水和抗生素组合；所述培养上清液为处于对数生长期的广泛耐药铜绿假单胞菌的培养上清液；所述培养上清液与所述蒸馏水的体积比为1:19～1:4；所述抗生素组合中的各抗生素的添加量均为0.016g/L。2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述NAC基础培养基的配方为蛋白胨20g/L、磷酸氢二钾0.3g/L、硫酸镁0.2g/L、溴棕三甲铵0.2g/L、萘啶酸0.015g/L和琼脂15g/L。3.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述培养上清液中含有铜绿假单胞菌分泌的群体感应物质，所述群体感应物质为N-酰基高丝氨酸内酯。4.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述抗生素组合包括碳青霉烯类抗生素、氨基糖苷类抗生素和喹诺酮类抗生素；所述碳青霉烯类抗生素为亚胺培南，所述氨基糖苷类抗生素为阿卡米星，所述喹诺酮类抗生素为环丙沙星。5.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述培养上清液与所述蒸馏水的体积比为1:9。6.权利要求1-5之一所述的培养基的制备方...

【专利技术属性】
技术研发人员：李小锋，李晨阳，金京勋，黄金玲，莫纯聪，李云飞，张美芳，
申请(专利权)人：广东和信健康科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44