本发明专利技术提供了一种检测人类c‑kit基因突变类型的试剂盒，它包括SEQ ID NO.1～283所示的引物对和SEQ ID NO.284所示的探针。本发明专利技术还公开了一种检测人类c‑kit基因11号外显子突变的方法。本发明专利技术试剂盒和方法可以准确检测人类c‑kit基因11号外显子的所有突变类型，为GIST患者的用药提供指导，临床应用前景良好。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因检测领域，具体涉及一种检测人类C-Kit基因11号外显子突变的诊断试剂盒和方法。
技术介绍
胃肠道间质瘤(gastrointestinal stromaltumors，GIST)是一类起源于胃肠道间叶组织的肿瘤，是胃肠道最常见的间叶源性肿瘤，多发于中老年患者，男女发病率无明显差异。Mazur等在1983年提出，GIST是一类区别于平滑肌瘤和神经源性肿瘤的独立肿瘤类型，其直接病因是癌基因获得性功能突变。早期治疗GIST主要依赖手术切除，但是即使肿瘤完全切除，也有很多患者死于肿瘤的复发和转移，而传统的放疗和化疗也没有明显的疗效。靶向药物特别是酪氨酸激酶抑制剂伊马替尼的出现使得GIST治疗发生了根本性的改变，现在对于GIST的治疗已发展为针对不同病情，采取包括手术、辅助治疗和新辅助治疗的个性化综合治疗。目前临床上治疗GIST的一线靶向药物是格列卫(伊马替尼，诺华制药)，二线药物索坦(舒尼替尼，辉瑞制药)，每个患者年消费均为十余万人民币。但靶向药物的疗效与有GIST患者有无基因突变及突变位点密切相关，不同的基因突变类型患者，辅助治疗的获益存在差异，因此靶向治疗之前需进行基因检测，以预测靶向治疗的疗效并指导靶向药物种类和剂量的选用。其规范的用药方案已经进入《中国胃肠间质瘤诊断治疗共识》(2013年版)。GIST患者根据其基因突变类型，可从分子水平分为3类：C-Kit突变型(80～85％)，PDGFRα突变型(5～10％)和野生型GIST(10％)。其中，C-Kit基因位于人染色体4q12-13，全长5230bp，含21个外显子。C-Kit基因的突变形式多样，包括缺失突变、点突变和插入突变，突变位点主要发生在第9号(10％)、11号(70％)、13号(1％)、17号外显子(1％)。研究表明，C-Kit基因突变不仅可协助明确诊断GIST，而且其突变位点与GIST靶向药物的治疗反应、用药剂量和预后有关。其中，从伊马替尼治疗反应上看，C-Kit基因有突变的GIST病例比C-Kit野生型病例治疗反应效果好，患者肿瘤无明显进展的生存期长；其中，C-Kit基因有突变的GIST病例中，11号外显子突变患者对伊马替尼最敏感，药物疗效最好。因此，检测GIST患者是否出现11号外显子突变，对于指导GIST患者的合理用药，以进行GIST个体化诊疗，具有重要参考价值。但是，目前检测人类C-Kit基因11号外显子突变，主要是通过传统的测序
方式，测序的耗费时间长且成本高，不利用普通的临床检测。即使有少数使用荧光定量PCR法的报道，也是仅对11号外显子的其中某一个位点进行检测，检测位点单一，无法对11号外显子进行多突变位点的全面评估，不能满足实际应用的需要。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种新的定量PCR检测人类C-Kit基因突变的试剂盒和方法。C-Kit基因11号外显子是GIST患者中最易发生突变的外显子，突变几乎涉及该外显子的每一个密码子。本专利技术设计的特定引物，可以用于检出已知11号外显子的所有突变类型。C-Kit基因11号外显子突变的部分已知突变类型如下：本专利技术提供了一种检测人类c-kit基因突变类型的试剂盒，它包括SEQ ID NO.1～283所示的引物对和SEQ ID NO.284所示的探针。其中，它还包括质控引物与质控探针：SEQ ID NO.285～287所示引物对与SEQ ID NO.284所示的探针。本专利技术还提供了上述试剂盒在制备检测人类c-kit基因11号外显子突变的试剂中的用途。本专利技术还提供了SEQ ID NO.1～283所示引物对。本专利技术还提供了SEQ ID NO.284所示的探针。本专利技术还提供了一种检测人类c-kit基因11号外显子突变的方法，它包括如下步骤：(1)提取样本DNA：取待检组织，提取其中的DNA；(2)基因扩增：用上述试剂盒对待检样本中的DNA进行扩增；(3)结果检测：对DNA扩增结果进行检测。只要本专利技术检测试剂盒和方法测出有突变，就可以确认C-Kit基因的11号外显子至少存在一种突变。从而可以预测GIST患者对靶向药物的治疗反应。本专利技术提供的试剂盒可以同时准确检测待检人群是否出现C-Kit基因的11号外显子上的274种突变位点，更能准确判断待检GIST患者的药物反应，为GIST患者的用药提供指导，且灵敏度高，特异性好，而且检测快速、简便，成本低廉，可以大量推广使用，临床应用前景良好。显然，根据本专利技术的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本专利技术上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。以下通过实施例形式的具体实施方式，对本专利技术的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本专利技术上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本专利技术上述内容所实现的技术均属于本专利技术的范围。附图说明图1为突变型样本测序结果图，所述突变为已知C11D组突变。图2为特异性检测结果图。图3为灵敏度检测结果图：编号1-5分别为浓度为8ng/ul、4ng/ul、2ng/ul、1ng/ul、0.5ng/ul的DNA扩增结果。具体实施方式下面以实施例作进一步说明，但本专利技术不局限于这些实施例。本专利技术所用的实验试剂与仪器如下：FastStartTaq DNA Polymerase：购自Roche公司，Cat No.12 032 937 001；Uracil DNA Glycosylase(UNG),heat labile 200U 2u/l：购自大连Takara公司，Cat No.2820；dU plus dNTP Mixture(12.5×)(dATP 2.5mM,dGTP 2.5mM,dCTP 2.5mM,dUTP 7.5mM,)：购自大连Takara公司，Cat No.4035。实施例1本专利技术检测C-Kit基因11号外显子突变的试剂盒和检测方法一、本专利技术试剂盒的组成PCR扩增试剂(1人份)：水14.85μl10XPCR buffer2.5μlMgCl2 25mM0.75μlUTP PLUS0.5μlPrimer溶液1μlUNG0.2μlTaq0.2μl总体系20μlc-kit基因11号外显子突变的扩增引物以及检测探针：引物如下：(引物均为5’-3’方向)(注：编号由三个数字+一个字母组成，其中，前两个数字代表第5XX位氨基酸；第三个数字代表该氨基酸密码子的第几个核苷酸；字母代表突变为某种核苷酸。例如，471A代表第547位氨基酸的三联密码子第1个核苷酸突变为A。本专利技术共涉及30个氨基酸的突变，共计274个突变位点)探针：外控引物及探针：二、采用本专利技术试剂盒检测C-Kit基因11号外显子突变1、样本DNA提取：可以使用Qiagen公司、天根公司、Promega公司等DNA提取试剂盒提取。以石蜡组织样本，用Qiagen公司试剂盒为例，提取DNA。1)利用手术刀取出组织边界无用的石蜡；2)将石蜡包埋组织切成4μm厚的薄片；3)迅速用灭菌小镊子取2—6枚装入DNase/RNase Free EP管中(每张摊开面积500(最大)mm2，即边长1.6cm的正方形大小；4)加入800μl二甲苯，振荡器上震荡10s，最大转数离心3分钟；5)加入800μl二甲苯，本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测人类c‑kit基因突变类型的试剂盒，其特征在于：它包括SEQ ID NO.1～275所示的引物对和SEQ ID NO.276所示的探针。
【技术特征摘要】
1.一种检测人类c-kit基因突变类型的试剂盒，其特征在于：它包括SEQ ID NO.1～275所示的引物对和SEQ ID NO.276所示的探针。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：它还包括质控引物与质控探针：SEQ ID NO.277～279所示引物对与SEQ ID NO.276所示的探针。3.权利要求1或2所述的试剂盒在制备检测人类c-kit基因11...
【专利技术属性】
技术研发人员：肖林，叶丰，陈卉娇，
申请(专利权)人：四川大学华西医院，
类型：发明
国别省市：四川;51
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