一种检测耐万古霉素肠球菌基因的引物、探针、方法及试剂盒技术

本发明专利技术涉及分子生物学技术领域，公开了一种检测耐万古霉素肠球菌基因的引物、探针、方法及试剂盒，采用Taqman探针实时荧光PCR法，分别针对16S rDNA、vanA、vanB核酸保守区设计引物和荧光标记探针，3个基因探针5’端均标记荧光报告基团FAM，3’端均标记荧光淬灭基团TAMRA。引物、探针配成PCR检测混合液后，加入酶与样本核酸，选用荧光PCR仪上的FAM通道进行扩增，通过荧光信号的变化实现目的基因的检测。本试剂盒具有准确率高、特异性强、灵敏度高的特点，能够对尿液样本中的肠球菌和VRE进行快速、准确检测。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及分子生物学
，尤其涉及一种检测耐万古霉素肠球菌基因的引物、探针、方法及试剂盒。
技术介绍
耐万古霉素肠球菌(Vancomycin-Resistant Enterococcus spp.，VRE)能引起尿路、腹腔、盆腔、外科手术感染及心内膜炎、脑膜炎等疾病，病死率达到21.0％～27.5％，是全球范围内主要的医院条件致病菌。其中，对人类致病的主要为粪肠球菌(Enterococcus faecalis)和屎肠球菌(Enterococcus faecium)，最常见的耐药基因型为vanA和vanB。肠球菌作为常见院内感染多重耐药菌，对头孢菌素类、部分氟喹诺酮类、氨基糖苷类等多种抗菌药物天然耐药。耐万古霉素肠球菌能将其耐药基因转移到其它病原微生物。因此，对人类构成严重威胁的不仅是VRE本身，还包括其耐药基因转移所产生的一些难以治疗的新耐药菌株。因此，加强VRE检测不仅有利于指导临床用药，而且有利于VRE抗性转移的检测和控制。目前临床上VRE主要通过细菌培养鉴定加药敏试验的方法检测，这种检测方法不仅操作繁琐、费时费力、灵敏度较低，重复性差，传统方法难以区分不同的基因型，而且无法了解抗性引起的分子生物学机制。
技术实现思路
本专利技术提供一种检测耐万古霉素肠球菌基因的引物、探针、方法及试剂盒，解决现有技术中VRE的检测不仅操作繁琐、费时费力、灵敏度较低，重复性差，传统方法难以区分不同的基因型，而且无法了解抗性引起的分子生物学机制的技术问题。本专利技术的目的是通过以下技术方案实现的：一种检测耐万古霉素肠球菌基因的引物和探针，检测肠球菌基因16S rDNA的引物核苷酸序列如SEQIDNO：2～3所示，检测肠球菌基因16S rDNA的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：4所示；检测耐万古霉素肠球菌特异性基因vanA的引物核苷酸序列如SEQIDNO：6～7所示，检测耐万古霉素肠球菌特异性基因vanA的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：8所示；检测耐万古霉素肠球菌特异性基因vanB的引物核苷酸序列如SEQIDNO：10～11所示，检测耐万古霉素肠球菌特异性基因vanB的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：12所示。一种检测耐万古霉素肠球菌基因的方法，包括：样本核酸制备，以获得核酸模板；分别针对肠球菌基因16S rDNA、耐万古霉素肠球菌特异性基因vanA、耐万古霉素肠球菌特异性基因vanB设计特异性引物和荧光标记探针，其中，检测肠球菌基因16S rDNA的引物核苷酸序列如SEQIDNO：2～3所示，检测肠球菌基因16S rDNA的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：4所示；检测耐万古霉素肠球菌特异性基因vanA的引物核苷酸序列如SEQIDNO：6～7所示，检测耐万古霉素肠球菌特异性基因vanA的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：8所示；检测耐万古霉素肠球菌特异性基因vanB的引物核苷酸序列如SEQIDNO：10～11所示，检测耐万古霉素肠球菌特异性基因vanB的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：12所示；取尿液样本、阳性对照品、阴性对照品置于离心管中，分别加入核酸抽提液充分混匀，并进行加热和离心处理，取上清液用于荧光PCR检测；配置酶试剂，其中，所述酶由水生栖热菌DNA聚合酶(Taq酶)和尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG酶)混合组成；将16S rDNA基因PCR检测混合液与酶试剂震荡混匀，进行离心处理；将vanA基因PCR检测混合液与酶试剂震荡混匀，进行离心处理；将vanB基因PCR检测混合液与酶试剂震荡混匀，进行离心处理分别取加酶混匀后的PCR检测混合液置于荧光PCR管中，取样本核酸
抽提上清液、阴性对照品核酸抽提上清液、阳性对照品核酸抽提上清液加入已有PCR检测混合液的荧光PCR管中，进行荧光PCR扩增，反应条件为：37℃×2min，94℃×2min，循环1次；93℃×15s，60℃×60s，循环40次；单点荧光检测在60℃，并在此采集荧光信号。对于16S rDNA基因、vanA、vanB基因，采用荧光PCR仪上的FAM通道进行扩增，通过荧光定量PCR仪所收集数据确定检测位点的基因型。一种检测耐万古霉素肠球菌基因的试剂盒，包括核酸抽提液、第一引物探针混合液、第二引物探针混合液、第三引物探针混合液、PCR反应酶系、阴性对照品、阳性对照品和分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒，其中，所述第一引物探针混合液由脱氧核糖核苷三磷酸dN(U)TP、16S rDNA基因的上、下游引物及一条荧光标记探针组成；所述第二引物探针混合液由脱氧核糖核苷三磷酸dN(U)TP、vanA基因的上、下游引物及一条荧光标记探针组成；所述第三引物探针混合液由脱氧核糖核苷三磷酸dN(U)TP、vanB基因的上、下游引物及一条荧光标记探针组成；其中，检测肠球菌基因16S rDNA的引物核苷酸序列如SEQIDNO：2～3所示，检测肠球菌基因16S rDNA的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：4所示；检测耐万古霉素肠球菌特异性基因vanA的引物核苷酸序列如SEQIDNO：6～7所示，检测耐万古霉素肠球菌特异性基因vanA的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：8所示；检测耐万古霉素肠球菌特异性基因vanB的引物核苷酸序列如SEQIDNO：10～11所示，检测耐万古霉素肠球菌特异性基因vanB的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：12所示。本专利技术的有益效果为：具有准确率高，临床试验结果与DNA测序结果总符合率99％以上；特异性强，与尿液中常见致病菌大肠埃希菌、肺炎克雷伯氏菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、变形杆菌、奇异变形杆菌、血链球菌、表皮葡萄球菌、白色念珠菌、产酸克雷伯菌、洋葱伯克霍尔德菌、鲍曼不动杆菌、白喉杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、流感嗜血杆菌、脑膜炎奈瑟菌均无交叉反应；灵敏度高，按照质粒拷贝数确定的最低检测限为103copies/mL，按照菌培养
法确定的最低检测限为103CFU/mL。本产品用于体外定性检测人尿液样本中肠球菌基因16S rDNA和耐万古霉素肠球菌特异性基因vanA和vanB，为临床确定肠球菌和VRE感染提供辅助诊断方法，为临床医生用药提供参考。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可根据这些附图获得其他的附图。图1为本专利技术实施例四的肠球菌感染样本的荧光定量PCR曲线图；图2为本专利技术实施例四的vanA型VRE感染样本的荧光定量PCR曲线图；图3为本专利技术实施例四的vanB型VRE感染样本的荧光定量PCR曲线图。具体实施方式为使本专利技术的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图和具体实施方式对本专利技术作进一步详细的说明。实施例一本专利技术实施例提供了一种检测耐万古霉素肠球菌基因的引物和探针，检测肠球菌基因16S rDNA的引物核苷酸序列如SEQIDNO：2～3所示，检测肠球菌基因16S rDNA的Taqman探针的核苷酸序列如SEQI本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测耐万古霉素肠球菌基因的引物和探针，其特征在于，检测肠球菌基因16S rDNA的引物核苷酸序列如SEQIDNO：2～3所示，检测肠球菌基因16S rDNA的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：4所示；检测耐万古霉素肠球菌特异性基因vanA的引物核苷酸序列如SEQIDNO：6～7所示，检测耐万古霉素肠球菌特异性基因vanA的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：8所示；检测耐万古霉素肠球菌特异性基因vanB的引物核苷酸序列如SEQIDNO：10～11所示，检测耐万古霉素肠球菌特异性基因vanB的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：12所示。

【技术特征摘要】
1.一种检测耐万古霉素肠球菌基因的引物和探针，其特征在于，检测肠球菌基因16S rDNA的引物核苷酸序列如SEQIDNO：2～3所示，检测肠球菌基因16S rDNA的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：4所示；检测耐万古霉素肠球菌特异性基因vanA的引物核苷酸序列如SEQIDNO：6～7所示，检测耐万古霉素肠球菌特异性基因vanA的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：8所示；检测耐万古霉素肠球菌特异性基因vanB的引物核苷酸序列如SEQIDNO：10～11所示，检测耐万古霉素肠球菌特异性基因vanB的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：12所示。2.根据权利要求1所述的检测耐万古霉素肠球菌基因的引物和探针，其特征在于，16S rDNA、vanA、vanB基因探针的核苷酸序列5’端均标记的荧光报告基团为FAM，3’端均标记的淬灭基团为TAMRA。3.一种检测耐万古霉素肠球菌基因的方法，其特征在于，包括：样本核酸制备，以获得核酸模板；分别针对肠球菌基因16S rDNA、耐万古霉素肠球菌特异性基因vanA、耐万古霉素肠球菌特异性基因vanB设计特异性引物和荧光标记探针，其中，检测肠球菌基因16S rDNA的引物核苷酸序列如SEQIDNO：2～3所示，检测肠球菌基因16S rDNA的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：4所示；检测耐万古霉素肠球菌特异性基因vanA的引物核苷酸序列如SEQIDNO：6～7所示，检测耐万古霉素肠球菌特异性基因vanA的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：8所示；检测耐万古霉素肠球菌特异性基因vanB的引物核苷酸序列如SEQIDNO：10～11所示，检测耐万古霉素肠球菌特异性基因vanB的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：12所示；取阳性对照品、阴性对照品置于离心管中，分别加入核酸抽提液充分混匀，并进行加热和离心处理，取上清液用于荧光PCR检测；配置酶试剂，其中，所述酶由水生栖热菌DNA聚合酶(Taq酶)和尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG酶)混合组成；将16S rDNA基因PCR检测混合液与酶试剂震荡混匀，进行离心处理；将vanA基因PCR检测混合液与酶试剂震荡混匀，进行离心处理；将vanB基因PCR检测混合液与酶试剂震荡混匀，进行离心处理；分别取加酶混匀后的PCR检测混合液置于荧光PCR管中，取样本核酸抽提上清液、阴性对照品核酸抽提上清液、阳性对照品核酸抽提上清液加入已有PCR检测混合液的荧光PCR管中，进行荧光PCR扩增，反应条件为：37℃×2min，94℃×2min，循环1次；93℃×15s，60℃×60s，循环40次；单点荧光检测在60℃，并在此采集荧光信号；对于16S rDNA基因、vanA、vanB基因，采用荧光PCR仪上的FAM通道进行扩增，通过荧光定量PCR仪所收集数据确定检测位点的基因型。4.一种检测耐万古霉素肠球菌基因的试剂盒，其特征在于，包括核酸抽提液、第一引物探针混合液、第二引物探针混合液、第三引物探针混合液、PCR反应酶系、阴性对照品、阳性对照品和分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒，其中，所述第一引物探针混合液由脱氧核糖核苷三磷酸dN(U)TP、16S rDNA基因的上、下游...

【专利技术属性】
技术研发人员：王伟建，倪剑锋，包婷婷，翁毅，
申请(专利权)人：宁波基内生物技术有限公司，王伟建，
类型：发明
国别省市：浙江;33