本文公开用于将编码涉及凝血的蛋白质的转基因序列插入细胞的基因组中以治疗包括血友病的病状的方法和组合物。在一个方面，本文描述非天然存在的锌指蛋白(ZFP)，该锌指蛋白结合至基因组中所关注区域(例如白蛋白基因)中的靶位点，其中ZFP包含一个或多个工程化的锌指结合结构域。在某些实施方案中，锌指结构域识别白蛋白基因中的靶位点。在一些实施方案中，锌指蛋白质包含称为并且排序为F1至F5或F1至F6的五个或六个锌指结构域，如表1的单行中示出。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】相关申请的交叉引用本申请要求2013年12月9日提交的美国临时申请号61/913,838和2014年2月24日提交的美国临时申请号61/943,884的权益，其公开内容全部以引用方式并入本文。在联邦科研资助下进行的本专利技术权利的声明不适用。
本公开是涉及基因修饰和血友病治疗领域。背景血友病诸如甲型血友病和乙型血友病，是凝血系统的遗传病症，其特征是出血至关节和软组织中，和过量出血至经历外伤或经历手术的任何位点。甲型血友病在临床上与乙型血友病难分辨，但是因子VIII(FVIII或F8)在甲型血友病中缺乏或不存在，而因子IX(FIX或F.IX)在患有乙型血友病的患者中缺乏或不存在。因子VIII基因编码血浆糖蛋白，所述血浆糖蛋白以其非活性形式与冯威勒布兰德氏因子相关联地进行循环。在表面损伤后，内在凝血级联启始并且因子VIII从复合物中释放并且变得活化。活化形式与因子IX一起操作来激活因子X变成活化Xa，最后导致纤维蛋白原变化至纤维蛋白和凝结诱导。参见，Levinson等人(1990)Genomics7(1):1-11。40-50％的甲型血友病患者患有涉及因子VIII内含子22的染色体倒位(也称为IVS22)。倒位的原因是因子VIII基因的内含子22中的9.6kb序列与位于因子
VIII基因远侧约300kb处的两个密切相关反向序列中的一个之间的染色体内重组事件，导致相对于外显子23至26的外显子1至22倒位。参见，Textbook of Hemophilia,Lee等人(编)2005,Blackwell Publishing。其他甲型血友病患者在因子VIII中具有缺陷，包括活性位点突变，和无义和错义突变。就其本身来说，因子IX(F.IX或FIX)编码涉及凝血系统的丝氨酸蛋白水解酶中的一个，并且已经证明恢复野生型因子IX蛋白质的正常循环水平的甚至3％可预防自发出血。额外血友病与其他凝血因子的异常表达相关联。举例来说，因子VII缺陷是在300,000至500,000人中的约1个人中发生的常染色体隐性性状并且与患者体内的不适当因子VII水平相关联。类似地，因子X缺陷也是在每500,000至1百万人中的1个人中发生的常染色体隐性性状，并且由FX基因的遗传变体导致。因子X缺陷可在患者群体中具有不同程度的严重性。乙型血友病的当前治疗依赖于长期、重复静脉内输注纯化重组因子IX并且受许多缺点影响。这包括需要重复静脉内输注，与抑制剂形成相关联，并且是预防性而非治愈性的。已经描述患有甲型或乙型血友病的患者的基因疗法，其涉及引入质粒和编码功能因子VIII或因子IX蛋白质的其他载体(例如，AAV)。参见例如美国专利号6,936,243；7,238,346和6,200,560；Shi等人(2007)J Thromb Haemost.(2):352-61；Lee等人(2004)Pharm.Res.7:1229-1232；Graham等人(2008)Genet Vaccines Ther.3:6-9；Manno等人(2003)Blood 101(8):2963-72；Manno等人(2006)Nature Medicin e 12(3):342-7；Nathwani等人(2011)Molecular Therapy 19(5):876-85；Nathwani等人(2011)；N Engl J Med.365(25):2357-65。然而，在这些方案中，形成抑制性抗-因子VIII或IX(抗-F8或抗-F.IX)抗体和针对递送媒介物的抗体仍然是血友病的基于因子VIII和因子IX替换的疗法的主要并发症。参见例如Scott&Lozier(2012)Br J Hae matol.156(3):295-302。已经描述基因组DNA的靶向裂解的各种方法和组合物。这些靶向裂解事件可用于例如诱导靶向诱变、诱导细胞DNA序列的靶向缺失，和促进预定染色体基因座处的靶向重组。参见，例如，美国专利号8,623,618；8,034,598；8,586,526；6,534,261；6,599,692；6,503,717；6,689,558；7,067,317；7,262,054；7,888,121；7,972,854；7,914,796；7,951,925；8,110,379；8,409,861；美国专利公布20030232410；20050208489；20050026157；20060063231；20080159996；201000218264；20120017290；20110265198；20130137104；20130122591；20130177983和20130177960和美国申请号14/278,903，其公开内容出于所有目的以引用方式全部并入。这些方法经常涉及使用工程化裂解系统来诱导双链断裂(DSB)或靶DNA序列中的切口以使得通过产生误差的过程诸如非同源末端连接(NHEJ)来修复断裂或使用修复模板的修复(同源性引导修复或HDR)可产生基因的剔除或插入所关注的序列(靶向整合)。此技术也可用于经由使用供体寡核苷酸来在基因组序列中引入位点特异性变化，包括引入基因组区域的特异性缺失，或特异性点突变或局部改变(也称为基因校正)。裂解可经由使用特异性核酸酶诸如工程化锌指核酸酶(ZFN)、转录活化剂样效应核酸酶(TAL EN)来发生，或使用具有工程化crRNA/tracr RNA(‘单一引导RNA’)的CRISPR/Cas系统来引导特异性裂解。此外，开发基于Argonaute系统(例如，来自嗜热栖热菌，被称为‘TtAgo’，参见Swarts等人(2014)Nature 507(7491):258-261)的靶向核酸酶，所述系统还可具有用于基因组编辑和基因疗法的潜力。如与典型整合方法相比，此核酸酶介导的靶向转基因插入方法提供改进转基因表达、增加安全和表达持久性的希望，因为它允许精确转基因定位以将基因沉默或活化相邻致癌基因的风险减少到最低限度。转基因可靶向整合至其同源基因座中，例如，将野生型转基因插入内源性基因座以校正突变基因。或者，转基因可插入非同源基因座例如“安全港”基因座中。已经描述一些安全港基因座，包括CCR5、
HPRT、AAVS1、Rosa和白蛋白。参见，例如，美国专利号7,951,925和8,110,379；美国公布号20080159996；201000218264；20120017290；20110265198；20130137104；20130122591；20130177983和20130177960和美国申请号14/278,903。举例来说，美国专利公布号20110027235涉及将功能性蛋白质靶向整合至分离干细胞中并且美国公布号20120128635描述治疗乙型血友病的方法。也参见Li等人(2011)Nature 475(7355):217-221和Anguela等人(2013)Blood122:3283-3287。然而，仍然需要治疗血友病的额外组合物和方法。概述本文公开用于靶向整合编码蛋白质，诸如功能凝血因子蛋白质(例如，因子VII、因子VIII、因子IX、因子X和/或因子XI本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种锌指蛋白，其包含称为并且排序为F1至F5或F1至F6的五个或六个锌指结构域，如在表1的单行中示出。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.12.09 US 61/913,838;2014.02.24 US 61/943,8841.一种锌指蛋白，其包含称为并且排序为F1至F5或F1至F6的五个或六个锌指结构域，如在表1的单行中示出。2.一种融合蛋白，其包含如权利要求1所述的锌指蛋白和野生型或工程化裂解结构域或裂解半结构域。3.一种多核苷酸，其编码一种或多种如权利要求1或权利要求2所述的蛋白质。4.一种表达载体，其包含如权利要求3所述的多核苷酸。5.如权利要求4所述的表达载体，其中所述载体是AAV载体。6.如权利要求5所述的表达载体，其中所述AAV载体是AAV2/6载体。7.一种药物组合物，其包含如权利要求4至6中任一项所述的表达载体。8.如权利要求7所述的药物组合物，其包含如权利要求4至6中任一项所述的第一表达载体，所述第一表达载体包含第一多核苷酸，和如权利要求4至6中任一项所述的第二表达载体，所述第二表达载体包含第二多核苷酸，其中所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸是不同的。9.如权利要求7所述的药物组合物，其包含(i)包含编码锌指核酸酶的多核苷酸的AAV载体，所述锌指核酸酶包含FokI裂解结构域和包含排序为F1至F5的5个锌指结构域的锌指蛋白质，其中每个锌指结构域包含识别螺旋区域并且其中所述锌
\t指蛋白质的所述识别螺旋区域在表1的第一行中示出(SEQ ID NO:4-8)；(ii)包含编码锌指核酸酶的多核苷酸的AAV载体，所述锌指核酸酶包含FokI裂解结构域和包含排序为F1至F6的6个锌指结构域的锌指蛋白质，其中每个锌指结构域包含识别螺旋区域并且其中所述锌指蛋白质的所述识别螺旋区域在表1的第二行中示出(SEQ ID NO:9-14)；和(iii)包含编码因子IX蛋白质的供体的AAV载体。10.如权利要求8所述的药物组合物，其中所述第一多核苷酸包含如SEQ ID NO.15的序列或由如SEQ ID NO.15的序列组成并且所述第二多核苷酸包含如SEQ ID NO.16的序列或由如SEQ ID NO.16的序列组成。11.如权利要求10所述的药物组合物，其进一步包含供体序列。12.如权利要求11所述的药物组合物，其中所述供体序列与表达载体缔合。13.如权利要求11所述的药物组合物，其中所述供体序列包含如SEQ ID NO.17的序列或由如SEQ ID NO.17的序列组成。14.如权利要求13所述的药物组合物，其中所述表达载体是AAV载体。15.如权利要求14所述的药物组合物，其中所述AAV载体是AAV2/6载体。16.如前述权利要求中任一项所述的药物组合物，其中至少一种蛋白质结合至细胞中的白蛋白基因。17.如前述权利要求中任一项所述的药物组合物，其进一步包含
\t药学上可接受的载体。18.一种裂解...
【专利技术属性】
技术研发人员：J·C·米勒，D·帕斯乔恩，E·J·瑞巴，
申请(专利权)人：桑格摩生物科学股份有限公司，
类型：发明
国别省市：美国;US
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