用于鉴定或辅助鉴定黑猪肉的PCR引物对、鉴定方法及应用技术

本发明专利技术提供一种用于鉴定或辅助鉴定黑猪肉的PCR引物对、鉴定方法及应用，本发明专利技术用于鉴定或辅助鉴定黑猪肉的PCR引物对，序列为F:5’‑AGCCATGAGCTGAGCAGGAC‑3’；R:5’‑GAAGCAGAGGCTGGACACCAT‑3’。用所述引物对，对待测猪肉DNA进行PCR扩增；根据扩增条带测序结果就可以判断待测猪肉是否为黑猪肉。本发明专利技术可准确判定猪肉的种源，鉴定结果准确、高效。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术用于鉴定或辅助鉴定黑猪肉的PCR引物对、鉴定方法及应用，涉及黑猪肉的分子标记
，特别涉及对黑猪肉的鉴别和检测技术。
技术介绍
肉类生产在人类生活中占有极其重要的地位，自1990年以来，我国肉类产品总产量和总消费量始终处于世界首位，从消费结构来看，中国居民的猪肉消费量占全国全部肉类总消费量的60％以上。随着社会的发展，居民消费水平逐渐提高，传统的供销模式难以满足人们日益增长的物质文明需求，越来越多的消费者开始关注饮食安全、健康和营养问题。因此我国猪肉产量和需求量还有较大的增长空间，特别是“优质放心猪肉”的潜在需求量较大，呈现出广阔的市场前景，具有巨大的经济和社会效益。我国地方猪种资源丰富，是世界猪遗传资源的重要组成部分。l986年出版的《中国猪品种志》，收录了我国48个地方猪品种资源，12个培育猪品种资源和6个引入猪品种资源。我国地方猪种大多为黑毛，因此地方猪又俗称黑猪或土猪。所谓黑猪肉，是指采用我国地方猪种且按照农家传统饲养方式“圈养”的家猪，而成为商品猪后并通过“传统人工宰杀的方式”屠宰后得到的猪肉。地方黑猪大多散养，对环境要求较高，用有机饲料或谷物喂养，生长周期一般为10-12个月，宰杀后，猪肉颜色深红，肌肉纤维致密，大理石纹清晰，肌肉内脂肪含量较高，蛋白质含量高，煮熟后肉质细嫩，香味浓郁，具有很高的食用营养价值；而市场常见的瘦肉型猪生产周期一般为5-6个月，猪肉颜色鲜红，肌肉纤维不致密，瘦肉内沉积的脂肪量少，其口味相对土猪肉香味较淡，口感一般。我国是猪肉生产和消费大国。近年来，随着市场多元化的发展以及人们生活水平的提高，对猪肉的需求已经不仅仅是能吃上，而是要既瘦肉多，又色、香、味俱全。但是长期以来，人们对猪的选育重点都集中在瘦肉率和生长速度上，而忽视了猪肉品质。导致许多消费者都反映，现在的猪肉不好吃、肉香味不足。一味的追求快大型和瘦肉型猪的选育，已经无法满足今后多元化的市场需求，更无法保证我国在猪肉生产和消费市场的竞争优势。随着人们对饮食安全、健康和营养要求的提高，传统优质地方猪肉(俗称黑猪肉)越来越受消费者欢迎。黑猪肉因其生产成本高，市售价格是普通瘦肉型猪肉几倍甚至十几倍。由于黑猪肉与普通猪肉直观难以辨别，一些不法商家以次充好、以假冒真，使得消费者和真正黑猪肉商家利益蒙受损害。因此，为了维持黑猪肉市场的稳定发展，急需科学的黑猪肉鉴别方法来规范目前的黑猪肉市场。我国地方猪种大多为黑毛，而外种猪为白色和棕色皮毛，因此，可以通过中国地方猪种特有的黑毛基因对黑猪肉进行科学鉴定。该技术可有效维护我国地方黑猪产业的可持续发展，规范黑猪肉市场。现有技术中还没有使用黑毛基因对黑猪肉进行鉴定的记载。
技术实现思路
为了解决以上黑猪肉鉴定方面的难题，本专利技术提供了用于鉴定或辅助鉴定黑猪肉的PCR引物对、鉴定方法及应用，可快速、准确判定猪肉的种源。为此，本专利技术，第一方面，提供用于鉴定或辅助鉴定黑猪肉的PCR引物对，所述引物对由SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的两条单链DNA分子组成。第二方面，提供用于鉴定或辅助鉴定黑猪肉的试剂盒，所述试剂盒中含有上述由SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的两条单链DNA分子组成的引物对。所述试剂盒中还含有dNTP和DNA聚合酶。根据需要还可以包含其他相关试剂。第三方面，提供所述的引物对或所述的试剂盒，在鉴定或辅助鉴定黑猪肉中的应用。第四方面，提供利用所述的引物对或所述的试剂盒，鉴定或辅助鉴定是否为黑猪肉的方法，步骤如下：(1)对目标肉样进行DNA提取；(2)使用权利要求1所述引物对，对步骤(1)中提取的DNA进行PCR扩增；(3)对步骤(2)中的扩增产物进行DNA测序；(4)根据测序结果即可直接判断目标肉样是否为黑猪肉：当步骤(2)中的扩增产物的碱基长度为471bp，同时，第423个碱基都为C碱基的纯合状态时，为纯种黑猪肉；当步骤(2)中的扩增产物的碱基长度为471bp，同时，第423个碱基都为C和T的杂合状态(同时存在C碱基和T碱基)时，为黑猪与外种猪杂交猪肉；当步骤(2)中的扩增产物的碱基长度为471bp，同时，第423个碱基都为T碱基的纯合状态时；或扩增产物碱基长度为473bp的DNA片段时，为普通猪肉，即非黑猪肉。其中，前者为棕毛猪肉，即杜洛克猪肉；后者为白毛或外种猪杂交猪肉。473bp的DNA片段与471bp的DNA片段相比，其第128个碱基处插入两个碱基CC。所述PCR扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，63.5℃复性30s，72℃延伸40s，30个循环；72℃终延伸7min。本专利技术的有益效果：建立了黑猪肉的DNA分子标记鉴定技术体系，可准确判定猪肉的种源，鉴定结果准确率可达100％。利用本专利技术技术可有效维护我国地方黑猪产业的可持续发展，规范黑猪肉市场，促进公平竞争，保护消费者权益。附图说明图1为采用本专利技术引物对对目标肉样进行PCR产物电泳图。具体实施方式下面结合具体试验方法和附图对本专利技术的技术方案及其所产生的技术效果进行进一步的阐述，下述说明仅是为了解释本专利技术，但不以任何方式对本专利技术加以限制，基于本专利技术教导所作的任何变换或替换，均属于本专利技术的保护范围。本专利技术中所使用的方法如无特殊说明，均为本领域常规方法。下述实施例中所用的试验材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1.用于鉴定或辅助鉴定黑猪肉的PCR引物对的设计与合成F:5’-AGCCATGAGCTGAGCAGGAC-3’R:5’-GAAGCAGAGGCTGGACACCAT-3’毛色是动物品种的重要特征之一，不同猪品种间毛色差异很大。毛色性状可作为一种遗传标记，在进行杂交育种过程中，可有助于获得所需要的、能稳定遗传的毛色类型。而MC1R基因是动物黑色素形成调控中的一个关键基因，对决
定动物的皮毛颜色起着重要的作用。MC1R通过与α-促黑素(α-MSH)及肾上腺皮质激素(ACTH)结合控制黑色素的形成。它能被黑素细胞刺激素(MSH)激活，导致黑素体中真黑素(黑色和褐色)的形成增加，然后通过黑素体转运到周围的毛发中。因此，本方法选用MC1R基因作为分子遗传标记进行黑猪肉的鉴定。针对MC1R基因，参考其编码序列(Ensembl序列号：ENSSSCG00000020924)设计了PCR引物对，该引物覆盖了MC1R基因的外显子1和外显子2的编码序列，通过其编码区的单核苷酸(SNP)突变类型来判定黑猪肉。实施例2.用于鉴定或辅助鉴定黑猪肉的试剂盒将实施例1设计合成的引物F和R分别单独包装后，与分别单独包装的dNTP、DNA聚合酶、10×buffer缓冲液等包装于同一试剂盒中，或者将引物F和R分别单独包装后，与SuperMix一同包装于同一试剂盒中，即得到本专利技术用于鉴定或辅助鉴定黑猪肉的试剂盒。实施例3.鉴定待测肉样是否为黑猪肉(1)样品准备选择纯种的莱芜黑猪、大蒲莲黑猪、大白猪、杜洛克猪及杂交的鲁莱黑猪、杜长大三元商品猪各3头，从其肌肉组织中提取基因组DNA，提取方法为通用方法。(2)PCR扩增将上述莱芜黑猪、大蒲莲黑猪、大白猪、杜洛克猪、鲁莱黑猪、杜长大三元商品猪6个猪种的基因组DNA各三份，用本专利技术引物对一一进行PCR扩增，然后凝胶本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于鉴定或辅助鉴定黑猪肉的PCR引物对，其特征是，所述引物对由SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的两条单链DNA分子组成。

【技术特征摘要】
1.用于鉴定或辅助鉴定黑猪肉的PCR引物对，其特征是，所述引物对由SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的两条单链DNA分子组成。2.用于鉴定或辅助鉴定黑猪肉的试剂盒，其特征是，所述试剂盒中含有权利要求1所述引物对。3.用于鉴定或辅助鉴定黑猪肉的试剂盒，其特征是，所述试剂盒中还含有dNTP和DNA聚合酶。4.权利要求1所述的引物对或权利要求2或3所述的试剂盒，在鉴定或辅助鉴定黑猪肉中的应用。5.利用权利要求1所述的引物对或权利要求2或3所述的试剂盒，鉴定或辅助鉴定是否为黑猪肉的方法，其特征是，步骤如下：(1)对目标肉样进行DNA提取；(2)使用权利要求1所述引物对，对步骤(1)中提取的DNA进行PCR扩增；(3)对步骤(2)中的扩增产物进行DNA测序；(4)根据测序结果即可直接判断目标肉样是否为黑猪肉。6.如权利要求5所述方法，其特征是，所述步骤(4)判断目标肉样是否为黑猪肉的标准是：a.当扩...

【专利技术属性】
技术研发人员：蔺海朝，王彦平，王继英，郭建凤，成建国，林松，
申请(专利权)人：山东省农业科学院畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：山东;37