一步法反转录PCR检测和分型寨卡病毒的试剂盒及其检测方法技术

本发明专利技术提供一步法反转录PCR检测和分型寨卡病毒的引物、探针及试剂盒，以及其检测方法和应用，以用于灵敏地、特异地、高效快速地同时检测和分型两种寨卡病毒基因型(亚洲型和非洲型)。本发明专利技术的设计原理在于：基于反转录PCR技术，建立一套适用于同时检测和分型两种寨卡病毒的一步法FRET‑PCR系统。此系统基于寨卡病毒两种基因型以及与之同源性较高的其他相关病原体的全基因序列，选择相对保守的区间设计引物和探针，通过特异性地扩增，可以灵敏、快速地从临床样品中检测并筛选出阳性样品，进而根据高分辨率熔解曲线中熔解温度Tm值的不同，从而可信度高地区分寨卡病毒亚洲型和寨卡病毒非洲型，该试剂盒和检测方法操作便捷高效，适合于检测大量样本。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物科学
，具体涉及一步法反转录PCR检测和分型寨卡病毒的试剂盒及其检测方法。
技术介绍
寨卡病毒病也称寨卡热(Zika fever)，是由寨卡病毒(Zika virus,ZIKAV)引起并通过伊蚊(主要包括埃及伊蚊Aedes aegypti，白纹伊蚊Aedes albopictus，非洲伊蚊Aedes Africana)等吸血昆虫进行传播的急性病毒性虫媒传染病。该病还可以由孕妇在怀孕或生产过程中传播给胎儿或婴儿，或者通过性传播或输血传播。寨卡病毒感染的潜伏期约为3-12天，以发热、皮疹、剧烈关节疼痛、肌肉疼痛以及结膜炎为主要临床症状，小儿感染病例还可出现神经系统、眼部和听力等改变，孕妇感染寨卡病毒可能导致新生儿小头畸形甚至胎儿死亡。寨卡病毒广泛分布于非洲大陆北部以及许多东南亚国家，包括印度、马来西亚、菲律宾、泰国、越南、巴基斯坦以及印度尼西亚，近年来在东非海岸、印度洋岛屿、美洲及加勒比海地区岛屿流行。截至2016年1月，在非洲、亚洲、美洲以及太平洋岛屿上至少45个国家均发现寨卡病毒传播的证据，其中在南美洲有23个国家和地区正在流行，且流行地区呈现不断扩大的趋势，感染病例数也不断上升。截止2016年2月28日，我国已发生8例输入性寨卡病毒感染病例。近年来，随着全球化进程的加快及全球变暖的加剧，为该病毒由流行地区向非流行地区的传播创造了条件；同时，由于寨卡热与登革热(Dengue fever)、黄病毒热(Yellow fever)、基孔肯雅热(Chikungunya fever)、日本脑炎(Japanese encephalitis)的临床症状相似且传播媒介类似，使得很多寨卡热被误诊为登革热和基孔肯雅热。目前尚无药物可以预防和治疗寨卡热。寨卡病毒属于黄病毒科，黄病毒属，单股正链RNA病毒。寨卡病毒全基因长度约为11Kb，直径40～70nm，有包膜，包含10794个核苷酸，编码3419个氨基酸，寨卡病毒基因编码3个结构蛋白：衣壳蛋白(C)、膜前体蛋白(prM)和包膜蛋白(M)，以及7个非结构蛋白(NS1，NS2a，NS2b，NS3，NS4a，NS4b和NS5)。根据分子生物学和生物信息学分析表明，寨卡病毒主要存在两个基因型：寨卡病毒非洲型(Zika virus African genotype)和寨卡病毒亚洲型(Zika virus Asian genotype)。目前寨卡病毒的检测方法主要有：(1)病毒分离培养。通过从感染机体内分离得到寨卡病毒，然后将该病毒接种在C6/36、BHK-21、Verona、Hela细胞和原代鼠肾细胞等细胞系或者乳鼠、蚊子等动物中培养增殖后进行判断。该检测方法具有灵敏度高、特异性强等优点，但是由于寨卡病毒的高致病性，对培养环境、操作人员、培养条件和仪器设备等有较高的要求；(2)血清学检测方法。该方法用抗原和抗体结合的理论，通过包被的抗原(或者抗体)检测人或动物的血清抗体(或者抗原)来进行判断。目前，寨卡病毒抗原血清学检测方法研究较少，抗体检测方法较多，主要包括免疫层析法、免疫荧光法、酶联免疫吸附法(ELISA)、血凝抑制法、病毒中和试验等。其中，免疫层析、免疫荧光和ELISA是目前实验室诊断和商业化试剂盒应用最广泛的血清学检测方法。由于寨卡病毒特异抗体一般需在机体感染病毒5天后才产生，此外，不同基因型的寨卡病毒之间，以及寨卡病毒和其他与之相近的病原体(如：登革热病毒、西尼罗河热病毒、黄热病病毒等黄病毒科病毒)之间会发生交叉反应(张硕，李德新。寨卡病毒和寨卡病毒病。病毒学报，2016，第32卷，第1期)，从而影响确诊。这些都使得该方法无法适用于在寨卡热集中爆发时进行快速和准确的检测和诊断；(3)分子生物学方法。该方法主要通过聚合酶链式反应(PCR)方法检测样本中有无寨卡病毒的RNA来进行判断。分子生物学方法具有所需样本来源多样(如：病毒培养液、血液、蚊子标本等均可)、样本用量少、检测快速准确、灵敏度高、特异性强等特点，使其成为目前应用最广泛的临床检测方法之一。其中应用的关键是确保RNA中无RNA酶和基因组DNA的污染。其中，反转录聚合酶链式反应技术(Reverse-Transcription Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)，是以实时荧光RT-PCR为主的分子生物学方法，为寨卡病毒感染的诊断、预防和控制提供了快速、准确、有效的诊断方法。使用常规的RT-PCR检测方法，一般在发病后4天内在感染者外周血中可检测到病毒核酸；而应用更灵敏的实时荧光RT-PCR技术，可以在感染当日或发病7日后可检测到病毒核酸。因此，对处于发热期的可疑病例，首选的实验室检测方法为实时荧光RT-PCR，而且可将PCR产物进行序列测定，准确判定是否为寨卡病毒感染或者感染的寨卡病毒的基因型。然而，现有的寨卡病毒PCR检测方法不能实时、特异和灵敏地检测或区分寨卡病毒核酸的两种基因型。寨卡病毒分为非洲型和亚洲型，寨卡病毒非洲型主要在非洲地区流行，而寨卡病毒亚洲型主要在东亚和东南亚地区流行，因此两种基因型的寨卡病毒存在基因水平上的差异，如果要同时检测两种基因型的寨卡病毒需要从两种基因型寨卡病毒的全基因序列中选择保守序列并巧妙地设计引物可以同时扩增两种基因型的寨卡病毒，但是不会扩增其他与之相近的的病毒；同时，如果要达到区分两种寨卡病毒基因型的目的，需要将阳性样品或可疑样品通过对PCR产物的基因测序后进行判定。因此，建立寨卡病毒的快速、方便、准确的检 验检测方法，有利于了解寨卡病毒的生物学特性、临床诊断，并将其应用于寨卡病毒感染的检测工作，对防止其传入我国具有重要意义。已公布中国专利申请(申请号：201610099248.7)提供了一种用于亚洲型寨卡病毒的荧光RT-PCR正向、反向引物和荧光寡核苷酸探针、试剂盒及检测方法，用以快速、高效、定性的检测样本中的亚洲型寨卡病毒。该专利申请的技术方案：1)只能检测寨卡病毒亚洲型；2)是利用水解探针(荧光寡核苷酸探针)的荧光反转录PCR进行检测，因而在进行相关样品检测时只有扩增曲线而没有熔解曲线，从而只能通过扩增曲线的有无来判定样品的阴阳性，无法有效地减少或避免假阳性结果，其检测结果的可行度有待提高；3)其试剂盒的最低检出限为1×103拷贝/mL。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种高度灵敏、特异、可以高效快速地检测和分型两种寨卡病毒基因型的引物、探针及试剂盒，以及其检测方法和应用。本专利技术的设计原理在于：基于反转录PCR技术，建立一套适用于同时检测和分型两种寨卡病毒的的一步法FRET-PCR系统。此系统基于寨卡病毒两种基因型以及与之同源性较高的其他相关病原体的全基因序列，选择相对保守的区间设计引物和探针，经过特异性地扩增，可以灵敏、快速地从临床样品中检测并筛选出阳性样品，进而根据高分辨率熔解曲线中熔解温度Tm值的不同，从而可信度高地区分寨卡病毒亚洲型和寨卡病毒非洲型。为了实现上述目的，本专利技术的技术方案如下：本专利技术提供了一种反转录PCR检测寨卡病毒的试剂盒，包括引物、探针和FRET-PCR标准品，其中：所述引物为上游引物和下游引物；所述上游引物具有SEQ ID No.1的核苷酸序列；所述下游引物具有SEQ ID No本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种一步法反转录PCR检测和分型寨卡病毒的引物和探针，其特征在于，所述引物包括上游引物和下游引物，所述探针包括6‑FAM探针和LCRed640探针，其中：所述上游引物具有SEQ ID No.1的核苷酸序列；所述下游引物具有SEQ ID No.2的核苷酸序列；所述6‑FAM探针具有SEQ ID No.3的核苷酸序列；所述LCRed640探针具有SEQ ID No.4的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种一步法反转录PCR检测和分型寨卡病毒的引物和探针，其特征在于，所述引物包括上游引物和下游引物，所述探针包括6-FAM探针和LCRed640探针，其中：所述上游引物具有SEQ ID No.1的核苷酸序列；所述下游引物具有SEQ ID No.2的核苷酸序列；所述6-FAM探针具有SEQ ID No.3的核苷酸序列；所述LCRed640探针具有SEQ ID No.4的核苷酸序列。2.一种一步法反转录PCR检测和分型寨卡病毒的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1所述的引物和探针，以及FRET-PCR标准品。3.如权利要求2所述的一种一步法反转录PCR检测和分型寨卡病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：PCR缓冲液、热启动Taq酶和dNTP。4.如权利要求2或者3所述的一种一步法反转录PCR检测和分型寨卡病毒的试剂盒，其特征在于，所述FRET-PCR标准品包括DNA质粒标准品和RNA标准品；其中，所述DNA质粒标准品是将具有SEQ ID No.5和SEQ ID No.6序列的核苷酸片段插入pUC57载体构建而成的重组质粒；所述RNA标准品是将含有SEQ ID No.5和SEQ ID No.6序列和T7启动子序列的质粒通过体外转录获得的RNA核苷酸。5.一种一步法反转录PCR检测和分析寨卡病毒的试剂盒的反转录PCR扩增检测体系，其特征在于，所述的反转录PCR扩增检测体系包括如下扩增体系：体积比为扩增体系总体积50％的样品RNA模板或者RNA标准品、1x PCR缓冲液、1μM如权利要求1所述的上游引物、1μM如权利要求1所述的下游引物、0.2μM如权利要求1所述的6-FAM探针、0.2μM如权利要求1所述的LCRed640探针、2个单位的商业化Taq酶、200μM dNTP、0.14个单位的商业化反转录酶和20个单位的商业化RNA酶抑制剂。6.如权利要求5所述的一种一步法反转录PCR检测和分析寨卡病毒的试剂盒的反转录PCR扩增检测体系，其特征在于，所述的反转录PCR扩增体系的反应条件包括：反转录、预变性、18个温度递减的高严谨循环、30个欠严谨的荧光获得循环和1个降温循环，其中：反转录：1x15min@55℃；预变性：1x2min@95℃；18个温度递减的高严谨循环：6x1sec@95℃，12sec@72℃，30sec@72℃；9x1sec@95℃，12sec@70℃，30sec@72℃；3x1sec@95℃，12sec@68℃，30sec@72℃；30个欠严谨的荧光获得循环：30x1sec@95℃，8sec@55-58℃，30sec@67℃ and 30sec@72℃；降温循环：1x1sec@40℃。7.一种一步法反转录PCR检测和分型寨卡病毒的试剂盒的实时荧光定量FRET-PCR扩增检测体系，其特征在于，所述的实时荧光定量FRET-PCR扩增检测体系包括如下扩增体系：体积比为
\t扩增体系总体积50％的样品DNA模板或者DNA质粒标准品、1x PCR缓冲液、1μM上游引物、1μM下游引物、0.2μM的6-FAM探针、0.2μM的LCRed640探针、2个单位的商业化Taq酶、和200μM dNTP。8.如权利要求7所述的一种一步法反转录PCR检测和分型寨卡病毒的试剂盒的实时荧光定量FRET-PCR扩增检测体系，其特征在于，所述的实时荧光定量FR...

【专利技术属性】
技术研发人员：王成明，张继垒，王瑶瑶，有金凤，仇海香，黄可，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32