本发明专利技术具体公开了一种基于在线监控碱液消耗率的乳酸菌高细胞密度培养方法。包括如下步骤：S1.采用装有pH传感器和碱液流加系统的发酵罐进行乳酸菌高细胞密度培养；S2.在培养过程中通过pH传感器和碱液流加系统保持培养过程中pH稳定；S3.在步骤S2的培养过程中，每隔0.5h～1.0h计算碱液消耗率，判断乳酸菌在培养过程中的增殖情况、补料时间和放罐时间。该方法可以及时、准确地判断培养过程中补料和放罐时间点；避免在线取样易染菌、活菌计数结果滞后、光密度测定对培养基澄清度要求高的问题，节省人力，因此具有更准确、更客观、更实时、更便捷的优点，可在乳酸菌高细胞密度培养中应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物过程控制和优化工程领域，具体涉及一种基于在线监控碱液消耗率的乳酸菌高细胞密度培养方法。
技术介绍
乳酸菌的高密度培养目前普遍采用培养过程补料和分批培养相结合的发酵方法，该方法的关键点在准确的掌握补料的时间以及发酵终止时间。这些关键点的控制主要是依靠预设参数的反馈控制。预设的参数包括光密度（OD值）、细胞计数和活菌数测定等。这些参数的测定都需要离线检测，需要不断通过取样口取样测定，不仅操作复杂，而且由于罐内气压平衡才能出料，就必需向罐中通入空气，这容易导致杂菌随之侵入造成污染，污染的风险随着取样频次的增加而增加。如进行乳酸菌活菌计数法，即为平板计数法，虽然准确性高，但耗时太长，需要48-72h才能获得计数结果。光密度法有时也可实现生物量的在线监测，但是受到培养基浊度、荧光性、粘度、阻抗、温度等影响和限制，从而影响测量的及时性、准确性和可靠性。
技术实现思路
本专利技术针对上述现有技术的不足，提供一种基于在线监控碱液消耗率的乳酸菌高细胞密度培养方法。本专利技术的上述目的是通过以下技术方案予以实现的。一种基于在线监控碱液消耗率的乳酸菌高细胞密度培养方法，具体包括如下步骤：S1.采用装有pH传感器和碱液流加系统的生物反应器进行乳酸菌高细胞密度培养；S2.培养过程中通过pH传感器和碱液流加系统保持发酵罐中乳酸菌培养液的pH稳定；S3.在步骤S2的培养过程中，每隔0.5h～1.0h记录碱液变化情况；S4.根据S3所得的碱液消耗率的变化趋势来判断乳酸菌高细胞密度培养过程中乳酸菌增殖情况，进而控制分批补料时间、过种时间和放罐时间。优选地，所述步骤S1中碱液为25～28%(w/w)氨水溶液、20～25%(w/w) NaOH溶液、20～25%(w/w) Na2CO3溶液或20～25%(w/w) (NH4)2CO3溶液。优选地，所述的乳酸菌菌株为鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）、植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）或动物双歧杆菌（Bifidobacterium animalis）。优选地，所述步骤S3中碱液消耗率的计算公式为：碱液消耗率=或V1：计时起始时碱液体积(mL)；m1：计时起始时碱液质量(g)；V2：计时结束时碱液体积(mL)；m2：计时结束时碱液质量(g)；t：计时时长(min)；碱液消耗率：mL/min或g/min。优选地，步骤S3所述根据碱液消耗率的变化趋势来判断乳酸菌增殖情况是指：当菌株增殖处于迟滞期时，碱液消耗率数值很小且变化不大；当罐内菌株生长处于对数期时，碱液消耗率数值不断增大。优选地，步骤S3所述根据所述碱液消耗率来判断分批补料时间、过种时间和放罐时间是指：对数期时，碱液消耗率突然将至很低，即为分批补料时间；补料后，碱液消耗率突增，此时为后对数期；分批补料结束后，碱液消耗率突然再次突降，即为移种或放罐时间。本专利技术提供的一种基于在线监控碱液消耗率的乳酸菌高细胞密度培养方法，是基于这样的构思：菌株在调整期时，增殖缓慢，代谢速率低，利用培养基中的碳源分泌乳酸少且慢，中和这些乳酸维持培养基中pH稳定所需的碱液量少；在对数期时，菌株迅速增长，代谢旺盛，迅速地利用培养基中的碳源和氮源进行分裂增殖，乳酸分泌量多，碱液补充量也随之增快增多；在稳定期时，菌株细胞数量稳定，总体的代谢速率、产酸速率以及碱液消耗速率稳定；在衰亡期时，菌株活性及数量急剧下降，菌株代谢能力减弱，产酸能力下降，碱液补充量也随之变少。因此，将碱液消耗量与时间参数相结合，不需要任何控制手段，仅需要计算出某个时间段培养液添加中和碱液的变化率，即碱液消耗速率，反映出菌株的增殖情况和代谢活力。而且碱液的消耗量测定，无论是体积变化还是质量变化，均可以直接肉眼观察读取数值。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：（1）直观实时：①相比于活菌计数法需要48-72h，采用碱液变化率的计算和监控，可以在线实时地反映乳酸菌高细胞密度培养过程中乳酸菌菌株的增殖情况；②可以准确、即时判断补料时间、过种时间和放罐时间等主要工艺参数，避免因碳源不足引起菌株发生衰退，菌株活力和活菌量下降；③有效缩短培养时间，避免造成操作滞后带来时耗和能耗，节约生产成本，提高生产效率。（2）稳定可靠：①通过直接观察记录碱液的变化量可以不受培养基温度、浊度、粘度、测定设备等因数对结果的影响，适用范围广；②该方法反映的是活菌的代谢情况，不受已衰亡菌细胞的影响，可靠性高。（3）便捷安全：①采用碱液变化率的计算和监控，跳过了以往监控的取样环节，可以大大降低发酵过程中因取样造成污染的风险；②同时也节约人力，减少操作难度、复杂性，更为便捷。附图说明图1为20L种子罐培养阶段NaOH消耗率。图2为200L发酵罐培养阶段NaOH消耗率图。图3为 20L发酵罐培养阶段NaOH消耗率。图4为 100L发酵罐培养阶段氨水消耗率。具体实施方式下面结合说明书附图和具体实施例对本专利技术作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本专利技术，并非用于限定本专利技术的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。实施例1第一步 采用装有pH传感器和25%NaOH自动流加系统的20L种子罐和200L放大发酵罐进行鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）高细胞密度培养，将装有30%NaOH试剂瓶放于天平上记重；第二步 培养过程中通过pH传感器和氨水自动流加系统保持发酵罐中植物乳杆菌培养液的pH稳定在5.7；第三步 在第二步的培养过程中，每隔30min记录试剂瓶中NaOH溶液的质量；第四步 将第三步所得的碱液体积按照如下公式计算的碱液消耗率（g/min）。碱液消耗率=m1：计时起始时碱液质量(g)m2：计时结束时碱液质量(g)t：计时时长(min)采用NaOH溶液质量变化率的变化趋势来判断植物乳杆菌高细胞密度培养过程中菌株增殖情况，进而判断分批补料时间、过种时间和放罐时间。最终所得的消耗碱液质量变化率变化趋势如图1和图2所示。本次培养，共耗时18.5小时，最终活菌数2.3×1010cfu/mL，达到了高密度培养的要求。实施例2第一步 采用装有pH传感器和20%NaOH自动流加系统的20L放大发酵罐进行植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）高细胞密度培养，将20%NaOH装于带有体积刻度的试剂瓶或量筒中；第二步 将1L摇瓶种子接入发酵罐中，培养过程中通过pH传感器和20%NaOH自动流加系统保持发酵罐中植物乳杆菌培养液的pH稳定在5.5；第三步 在第二步的培养过程中，每隔30min记录试剂瓶或量筒中NaOH溶液的体积；第四步 将第三步所得的碱液质量按照如下公式计算的碱液消耗率（mL/min）。碱液消耗率=V1：计时起始时碱液体积(mL)V2：计时结束时碱液体积(mL)t：计时时长(min)采用NaOH溶液体积变化率的变化趋势来判断植物乳杆菌高细胞密度培养过程中菌株增殖情况，进而判断分批补料时间和放罐时间。最终所得的消耗碱液体积变化率变化趋势如图3所示。本次培养，共耗时9小时，最终活菌数1.2×1010cfu/mL，达到了高密度本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种基于在线监控碱液消耗率的乳酸菌高细胞密度培养方法，其特征在于，包括如下步骤：S1.采用装有pH传感器和碱液流加系统的发酵罐进行乳酸菌高细胞密度培养；S2.培养过程中通过pH传感器和碱液流加系统保持发酵罐中乳酸菌培养液的pH稳定；S3.在步骤S2的培养过程中，每隔0.5h～1.0h记录碱液变化情况；S4.根据S3所得的碱液消耗率的变化趋势来判断乳酸菌高细胞密度培养过程中乳酸菌增殖情况，进而控制分批补料时间、过种时间和放罐时间。
【技术特征摘要】
1.一种基于在线监控碱液消耗率的乳酸菌高细胞密度培养方法，其特征在于，包括如下步骤：S1.采用装有pH传感器和碱液流加系统的发酵罐进行乳酸菌高细胞密度培养；S2.培养过程中通过pH传感器和碱液流加系统保持发酵罐中乳酸菌培养液的pH稳定；S3.在步骤S2的培养过程中，每隔0.5h～1.0h记录碱液变化情况；S4.根据S3所得的碱液消耗率的变化趋势来判断乳酸菌高细胞密度培养过程中乳酸菌增殖情况，进而控制分批补料时间、过种时间和放罐时间。2.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述碱液为25～28%(w/w)氨水溶液、20～25%(w/w) NaOH溶液、20～25%(w/w) Na2CO3溶液或20～25%(w/w) (NH4)2CO3溶液。3.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述步骤S2中的pH稳定范围是5.5～6.0。4.据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述的乳酸菌菌株为鼠李...
【专利技术属性】
技术研发人员：鲍志宁，林伟锋，夏枫耿，
申请(专利权)人：广州市微生物研究所，华南理工大学，
类型：发明
国别省市：广东;44
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