本发明专利技术属于生物检测技术领域，公开了一种塞内加谷病毒实时荧光定量PCR检测引物及试剂盒；首先通过设计并筛选得到一种塞内加谷病毒实时荧光定量PCR检测引物和探针，所述上游引物、下游引物和探针的序列如SEQ ID NO：1～3所示；利用该引物和探针可特异性扩增出来塞内加谷病毒，实时荧光定量可通过实时监测PCR过程中双链DNA荧光染料与PCR扩增产物的结合情况，采集荧光数据，根据CT值来鉴别SVV；利用所述方法进行PCR扩增后即可鉴别SVV，准确性高、特异性好，重复性好，可以准确、快速、高效地进行鉴定SVV，有利于在临床实践中推广应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物检测
，更具体地，涉及一种塞内加谷病毒实时荧光定量PCR检测引物及试剂盒。
技术介绍
塞内加谷病毒（Seneca Valley virus SVV）是单股正链RNA病毒，是小核糖核酸病毒科Senecavirus病毒属的典型代表。其最初被认为是PER.C6细胞培养物中的污染物，随后在美国和加拿大的猪群中被分离，2007年在美国一屠宰场的猪群中出现水疱性疾病临床症状，约80%的猪出现跛足，PCR检测猪口蹄疫、猪水疱病、水疱性口炎和水疱性疹均为阴性，而SVV却为阳性，从而被认为是原发性水疱性疾病。近期猪塞内加谷病毒（SVV）在巴西猪群中的感染与爆发，证明了猪塞内加谷病毒很有可能是猪的原发性水疱性疾病病原之一。2015年我国及巴西出现了几次SVV感染猪群并出现严重的临床发病及死亡症状，造成严重的经济损失。SVV在临床上所引起的临床症状与其他一些猪的水泡病极为相似，在临床和组织病理学上很难区分，这就给该病的确诊带来一定难度，其鉴别诊断通常需借助实验室诊断技术，传统的检测方法费时费力，操作方法繁琐，不利于疾病的及时诊断治疗。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是克服现有技术中塞内加谷病毒检测所存在的上述缺陷，提供一种特异性检测塞内加谷病毒实时荧光定量PCR的引物。本专利技术的第二个目的是提供含上述检测引物的试剂盒。本专利技术的目的是通过以下技术方案予以实现的：一种塞内加谷病毒实时荧光定量PCR检测引物和探针，所述上游引物、下游引物和探针的序列如SEQ ID NO：1～3所示。优选地，所述探针的5’端标记的是荧光报告基团；3’端标记的是淬灭基团。更优选地，所述荧光报告基团为FAM，所述淬灭基团为TAMAR。本专利技术还提供含有所述塞内加谷病毒实时荧光定量PCR检测引物和探针的试剂盒。优选地，所述上游引物、下游引物和探针的浓度为10 μM。优选地，所述试剂盒还包括PCR反应缓冲液、荧光染料、阳性标准品。更优选地，所述阳性标准品的制备方法是从SVV细胞病毒抽提RNA并反转录成cDNA，再经PCR将SVV-3C基因扩增出来，得到与目的片段大小一致的扩增产物。PCR产物回收后，经与PMD19-T载体连接、转化、扩增含有目的片段的重组质粒，经菌液PCR以及测序鉴定，证实已成功地构建了SVV重组质粒标准品，命名为PMD19-T-3C，作为阳性标准品待用。优选地，所述试剂盒进行荧光定量PCR的反应体系为：Premix Ex Taq（Probe qPCR）（2×）10μL、10 μM，0.4μL上游引物、10 μM，0.4μL下游引物、ROX Reference Dye II（50×）0.2μL、10 μM，0.8μL探针、DNA模板2.0μL、ddH2O 6.2μL。优选地，所述试剂盒进行进行荧光定量PCR的反应条件为：95℃ 30 秒，95℃ 5 秒，60℃ 34 秒，40个循环。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：本专利技术通过设计并筛选得到一种塞内加谷病毒实时荧光定量PCR检测引物和探针，所述上游引物、下游引物和探针的序列如SEQ ID NO：1～3所示；利用该引物和探针可特异性扩增出来塞内加谷病毒，实时荧光定量可通过实时监测PCR过程中双链DNA荧光染料与PCR扩增产物的结合情况，采集荧光数据，根据CT值来鉴别SVV；利用所述方法进行PCR扩增后即可鉴别SVV，准确性高、特异性好，重复性好，可以准确、快速、高效地进行鉴定SVV，有利于在临床实践中推广应用。附图说明图1为重组质粒标准品PMD19-T-3C的PCR扩增结果。图2为实时荧光定量PCR的标准曲线。图3为实时荧光定量PCR的灵敏性试验；其中1为1×109copies/μL；2为1×108copies/μL；3为1×107copies/μL；4为1×106copies/μL；5为1×105copies/μL；6为1×104copies/μL；7为1×103copies/μL；8为1×102copies/μL；9为1×101copies/μL；10为1×100copies/μL；11为阴性对照。图4为实时荧光定量PCR的特异性试验，其中1为SVV；2为FMDV；3为SVDV；4为VSV；5为PRRSV；6为PCV；7为PRV；8为PK-15细胞。具体实施方式下面将结合说明书附图和具体实施例进一步说明本专利技术的内容，但不应理解为对本专利技术的限制。不背离本专利技术精神和实质的情况下，对本专利技术方法、步骤、条件所作的修改或替换，均属于本专利技术的范围。若无特别说明，实施例中所用的实验方法均为本领域技术人员所熟知的常规方法和技术，试剂或材料均为通过商业途径得到。实施例1 标准阳性模板的制备一、病毒总RNA的抽提按Invitrogen公司TRIZOL LS Reagent RNA提取试剂盒使用说明书进行。在1.5 mL eppendorf管中加入250 µL已分装好的细胞繁殖所得的病毒液上清和750 µL TRIZOL，充分混匀，室温放置10 min；加入200 µL的氯仿，剧烈摇动15sec，室温静置5min，4℃，12000 rpm离心15 min；将上清转移到新的1.5 mL eppendorf管中，加入500 µL异戊醇，充分混匀，室温放置10min，4℃，12000 rpm离心10 min；弃去上清液，沉淀用冰预冷的70%乙醇1000 µL，轻轻混匀，洗涤一次，4℃，12000 rpm离心10 min；弃去上清液，风干；用20 µL DEPC处理的三蒸水溶解RNA，-80℃保存或直接用于反转录。二、引物设计根据GenBank中SVV-001（DQ641257）的3C区域基因序列，设计PCR引物：上游引物P1: 5’-ATCCTTTTGCTGCCCATGTG-3’，下游引物P2: 5’-AGAACTCTACCCAACGCCTC-3’，利用该引物扩增3C基因，反应体系如下：PremixTaq 25μL、上游引物P1 1μL、下游引物P2 1μL、模板DNA 1μL，最后用ddH2O补足反应体系总体积为50μL。扩增程序为：（1）94℃预变性5min，（2）94℃变性1min，57℃退火30 s，72℃延伸30 s，共32个循环；（3）72℃延伸10min。回收PCR产物（参照Omega公司E.Z.N.A.® Gel Extraction Kit的使用说明书），进行琼脂糖凝胶电泳，鉴定为正确的目标片段，用于后续的克隆。三、目的基因的克隆（1）回收产物连接pMD19-T载体参照pMD®19-T Vector试剂盒说明书，连接反应体系为：纯化的PCR产物2μL、pMD19-T vector 0.5μL、Solution I 2.5μL；最终连接反应体系的总体积为5μL。将上述反应体系混匀并稍作离心后，4℃连接过夜。（2）连接产物转化将（1）的连接产物5μL轻轻地加到50μL的大肠杆菌感受态细胞中，冰浴30min；42℃热休克90s然后迅速转移到冰浴中冷却2min；加到200μL LB液体培养基中，37℃，160rpm振摇培养45min，使大肠杆菌复苏，抗性基因表达；将以上复苏的感受态细胞均匀涂布Amp+/LB固体培养基平皿，37℃培养过夜。（3）本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种塞内加谷病毒实时荧光定量PCR检测引物和探针，其特征在于，所述上游引物、下游引物和探针的序列如SEQ ID NO：1～3所示。
【技术特征摘要】
1.一种塞内加谷病毒实时荧光定量PCR检测引物和探针，其特征在于，所述上游引物、下游引物和探针的序列如SEQ ID NO：1～3所示。2.根据权利要求1所述塞内加谷病毒实时荧光定量PCR检测引物和探针，其特征在于，所述探针的5’端标记的是荧光报告基团；3’端标记的是淬灭基团。3.根据权利要求2所述塞内加谷病毒实时荧光定量PCR检测引物和探针，其特征在于，所述荧光报告基团为FAM，所述淬灭基团为TAMAR。4.含有权利要求1至3任一项所述塞内加谷病毒实时荧光定量PCR检测引物和探针的试剂盒。5. 根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述上游引物、下游引物和探针的浓度为10 μM。6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试...
【专利技术属性】
技术研发人员：马静云，赵晓亚，陈桂华，伍绮文，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东;44
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