一种基于细胞表型的高内涵多指标肾毒性的检测方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种基于细胞表型的高内涵多指标肾毒性的检测方法，包括：采用能够对细胞核或线粒体功能改变进行特异性检测的荧光分子探针对细胞进行标记，并以高内涵筛选系统作为检测手段，基于高内涵筛选系统对已经加入待测药物的活细胞进行成像分析，得出所述待测药物对细胞数量、细胞核及线粒体的至少一种影响，从而判断对细胞的影响。本发明专利技术还公开了一种基于细胞表型的高内涵多指标肾毒性的检测方法的应用。本发明专利技术能够在保持细胞结构和功能完整性的前提下同时对多个指标进行检测，具有快速、高通量、低成本、高准确性的特点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及药物毒性检测领域，具体涉及一种基于细胞表型的高内涵多指标肾毒性检测方法及其应用。
技术介绍
中草药在我国应用于临床已有2000多年的历史，但其毒副作用的研究才刚刚起步，药物毒性是在中药研发及临床使用过程中经常出现的不良反应。由于人们对中药安全性问题认识存在不足，自行、长期、大量、盲目服用中草药导致的中药药源性损伤近期逐年增多，肾脏因其所司功能和独特的血液循环特点是不良反应极易伤及的器官。对于药物早期肾毒性的研究主要以动物或人与动物的肾脏细胞为实验模型。然而传统的动物毒理实验存在时间长、成本高、通量低、动物使用量大、动物个体差异大、受实验伦理学制约等缺点。常用的肾毒性细胞模型检测方法有MTT法、细胞周期检测、线粒体膜电位检测、细胞凋亡检测等，这些方法指标单一，灵敏度低，难以适应中药成分复杂的特点。高内涵检测技术可以在保持细胞结构和功能完整性的前提下同时对多个指标进行检测，具有快速、高通量、低成本、高准确性的优势，且已成功应用于肝毒性、心脏毒性、神经毒性及遗传毒性评价，对早期发现药物毒性，减少药物研发成本具有极大的价值。目前，尚无将高内涵检测技术应用于肾脏毒性评价的相关文献报道，针对与此，将高内涵检测手段运用于肾毒性药物的检测，评价药物是否具有肾毒性，并尝试将此方法用于文献查阅到的多种具有潜在肾毒性的中药单体成分检测，以验证方法的灵敏度和准确性，从而为更为快速、经济有效的评价中药安全性提供更多的可能。
技术实现思路
基于上述现有技术中存在的问题，本专利技术设计开发了一种基于细胞表型的高内涵多指标肾毒性的检测方法，目的是通过高内涵检测技术应用于肾毒性的评价，在保持细胞结构和功能完整的前提下同时对多个指标进行检测，具有快速、高通量、低成本、高准确性的特点。本专利技术还设计开发了一种基于细胞表型的高内涵多指标肾毒性的检测方法的应用，从而为更为快速、准确、经济、有效的评价中药安全性提供更多的可能。本专利技术提供的技术方案为：一种基于细胞表型的高内涵多指标肾毒性检测方法，包括：采用能够对细胞核或线粒体功能改变进行特异性检测的荧光分子探针对细胞进行标记，并以高内涵筛选系统作为检测手段，基于高内涵筛选系统对已经加入待测药物的活细胞进行成像分析，得出所述待测药物对细胞数量、细胞核及线粒体的至少一种影响，从而判断对细胞的影响。优选的是，所述待测药物包括：马兜铃酸A、环孢素A和顺铂，计算检测浓度为0.01-100μmol/L范围内对细胞数量、细胞核及线粒体的至少一种影响。优选的是，所述待测药物样本用MEM基础培养基溶解稀释至0.01μmol/L，配置于离心管中，铝箔避光-20℃密封保存。优选的是，所述细胞为HEK293细胞，其用含10％胎牛血清、1％青链霉素的MEM培养基培养，细胞在37℃、5％CO2培养箱培养，每三天传代一次。优选的是，所述荧光分子探针为Hoechst 33342、Mitotracker Deep Red FM或Rhodamine123。优选的是，在所述成像分析时，选择Hoechst 33342、Mitotracker Deep Red FM和/或Rhodamine 123通道进行活细胞成像。优选的是，检测所述药物对所述细胞的影响时，计算细胞数量、细胞核面积、细胞核圆度、线粒体质量和线粒体膜电位指标，考察药物对细胞的影响。优选的是，所述高内涵筛选系统作为检测手段，具体操作包括：细胞接种于孔板之后，收集对数生长期细胞，以1×104个/mL浓度加入培养板，
100μL/孔，37℃，5％CO2培养箱中培养24h后加入用MEM基础培养基稀释的所述待测药物，37℃避光，5％CO2培养24小时后，加入含Hoechst 33342和Mitotracker Deep Red FM的MEM基础培养基50μL/孔，37℃避光，5％CO2培养30min，再加入含Rhodamine123的MEM基础培养基100μL/孔，37℃避光，5％CO2培养30min，选择Hoechst 33342、Mitotracker Deep Red FM和/或Rhodamine 123通道进行活细胞成像，对图像进行采集，计算细胞数量、细胞核面积、细胞核圆度、线粒体质量、线粒体膜电位5个指标的IC50值检测对细胞的影响。一种基于细胞表型的高内涵多指标肾毒性检测方法的应用，用于具有肾毒性中药单体的筛选。优选的是，对所述中药单体对细胞的影响检测选择细胞数量、细胞核面积、细胞核圆度、线粒体质量和线粒体膜电位5个指标的IC50值。本专利技术与现有技术相比较所具有的有益效果：在专利技术中通过高内涵多指标肾毒性检测方法的建立过程中，分别选择了马兜铃酸A、环孢素A和顺铂三种机理不同且临床有不同用途但都以其严重的肾脏毒性而使用受限的药物及通过本方法对2种具有肾毒性报道但机理尚不明确的中药单体进行检测，本专利技术所测得的阳性药半数致死量与文献报道接近，并且单体筛选检测浓度低，效果明显，证明基于多指标高内涵所建立的肾毒性检测方法相较其他传统方法而言，具有检测更灵敏、结果更准确、评价指标更加全面并且操作更方便的优势，并且在保持细胞结构和功能完整性的前提下，可以同时对细胞核和线粒体的形态和功能等多个指标进行精确的检测及分析，也不受不同药物对肾脏毒性的不同损害机理的限制，为中药及其单体成分肾毒性研究做出初步判断，可成功应用于中药单体成分及中药新药的毒性评价与筛选。附图说明图1为本专利技术所述3种阳性待测药物的高内涵代表图像。图2a为3种阳性药对细胞存活率变化情况的量效关系曲线，数据表示为：
mean±SEM，n＝4。图2b为3种阳性药对线粒体质量变化情况的量效关系曲线，数据表示为：mean±SEM，n＝4。图2c为3种阳性药对线粒体膜电位变化情况的量效关系曲线，数据表示为：mean±SEM，n＝4。图2d为3种阳性药对细胞核面积变化情况的量效关系曲线，数据表示为：mean±SEM，n＝4。图2e为3种阳性药对细胞核圆度变化情况的量效关系曲线，数据表示为：mean±SEM，n＝4。图3为雷公藤甲素和斑蝥素的高内涵代表图像。图4a为雷公藤甲素和斑蝥素对存活率变化情况的量效关系曲线，数据表示为：mean±SEM，n＝3。图4b为雷公藤甲素和斑蝥素对线粒体质量变化情况的量效关系曲线，数据表示为：mean±SEM，n＝3。图4c为雷公藤甲素和斑蝥素线粒体膜电位变化情况的量效关系曲线，数据表示为：mean±SEM，n＝3。图4d为雷公藤甲素和斑蝥素细胞核面积变化情况的量效关系曲线，数据表示为：mean±SEM，n＝3。图4e为雷公藤甲素和斑蝥素细胞核圆度变化情况的量效关系曲线，数据表示为：mean±SEM，n＝3。具体实施方式下面结合附图对本专利技术做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。本专利技术提供了一种基于细胞表型的高内涵多指标肾毒性检测方法，包括：采用能够对细胞核或线粒体功能改变进行特异性检测的荧光分子探针对细胞进行标记，并以高内涵筛选系统作为检测手段，基于高内涵筛选系统对已经加入待测药物的活细胞进行成像分析，得出所述待测药物对细胞数量、细胞核及线粒体的至少一种影响，从而判断对细胞的影响。在另一种实施例中，所述待测药物包括：马兜铃酸A本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于细胞表型的高内涵多指标肾毒性检测方法，其特征在于，包括：采用能够对细胞核或线粒体功能改变进行特异性检测的荧光分子探针对细胞进行标记，并以高内涵筛选系统作为检测手段，基于高内涵筛选系统对已经加入待测药物的活细胞进行成像分析，得出所述待测药物对细胞数量、细胞核及线粒体的至少一种影响，从而判断对细胞的影响。

【技术特征摘要】
1.一种基于细胞表型的高内涵多指标肾毒性检测方法，其特征在于，包括：采用能够对细胞核或线粒体功能改变进行特异性检测的荧光分子探针对细胞进行标记，并以高内涵筛选系统作为检测手段，基于高内涵筛选系统对已经加入待测药物的活细胞进行成像分析，得出所述待测药物对细胞数量、细胞核及线粒体的至少一种影响，从而判断对细胞的影响。2.如权利要求1所述的基于细胞表型的高内涵多指标肾毒性检测方法，其特征在于，所述待测药物包括：马兜铃酸A、环孢素A和顺铂，计算检测浓度为0.01-100μmol/L范围内对细胞数量、细胞核及线粒体的至少一种影响。3.如权利要求1或2所述的基于细胞表型的高内涵多指标肾毒性检测方法，其特征在于，所述待测药物样本用MEM基础培养基溶解稀释至0.01μmol/L，配置于离心管中，铝箔避光-20℃密封保存。4.如权利要求3所述的基于细胞表型的高内涵多指标肾毒性检测方法，其特征在于，所述细胞为HEK293细胞，其用含10％胎牛血清、1％青链霉素的MEM培养基培养，细胞在37℃、5％CO2培养箱培养，每三天传代一次。5.如权利要求4所述的基于细胞表型的高内涵多指标肾毒性检测方法，其特征在于，所述荧光分子探针为Hoechst 33342、Mitotracker Deep Red FM或Rhodamine123。6.如权利要求4或5所述的基于细胞表型的高内涵多指标肾毒性检测方法，其特征在于，在所述成像分析时，选择Hoechst 33342、Mitotracker Deep Red FM和/或Rhodamine 123通道进行活细胞成像。7....

【专利技术属性】
技术研发人员：朱彦，王萌，任晓亮，高秀梅，崔英，姜苗苗，王晓明，邵瑞，郭晓，张慧杰，谭乐俊，
申请(专利权)人：天津中医药大学，
类型：发明
国别省市：天津;12