本发明专利技术公开了一种湖泊水生植物中有机磷提取方法，包括样品采集、磷的基本组成测定、有机磷(Po)的提取、样品测试预处理、液态核磁(31P‑NMR)分析和计算步骤。本发明专利技术采用0.5mol/L NaOH+25mmol/L EDTA提取剂，水生植物粉末样品与提取剂的固液比为1：60获得最优的Po提取效果；31P‑NMR分析测试过程中，设置延迟时间(D1)为5s，扫描分析时间为15h可获得较好的谱图。本发明专利技术的水生植物Po的提取方法，总磷(TP)和Po的平均提取率分别在91.4％和88.1％以上，能准确检测出样品中Po的具体种类和含量，准确的反映湖泊中水生植物的Po的组成结构特征。为研究湖泊水生植物中Po的生物地球化学特征及其在水华暴发中所起的贡献提供科学依据。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种有机磷的提取及组成分析方法，特别是一种湖泊水生植物中有机磷提取及组成分析方法。
技术介绍
磷是水生生态系统关键的限制性营养元素之一，是影响湖泊富营养化的重要因素。外源输入和内源循环是导致湖泊水体磷大幅度增加的主要因素。近年来，包括生活污水、工农业生产、土壤径流等过程携带的外源磷输入得到了一定的控制，湖泊内源磷的释放成为引起湖泊水质进一步恶化的关键因素。沉积物释放是湖泊内源磷污染重要的来源之一，但富营养化湖泊中广泛存在的水生植物，其死亡腐烂分解后的产物可能是湖泊内源磷另一个重要的来源。例如，太湖是是中国第三大淡水湖，也是典型的富营养大型浅水湖泊，位于30°55′40″～31°32′58″N，119°52′32″～120°36′10″E之间，水面面积为2250km2，湖泊平均水深1.9m，最大水深2.6m。太湖东南部草型湖湾(东太湖)水体表面覆盖着高达东太湖总面积70％以上的水生植物，这些水生植物死亡腐烂后如果不及时收割，其腐解后的有机物将会进入水体，其中磷的释放率远高于碳和氮，半个月内磷的释放量就可高达70％，这些营养元素的释放将会引起湖泊水体的二次污染，危害生态系统健康，进而引起一系列环境问题。近年来，由于人类活动强度的增加，太湖水质不断恶化，水化学环境也发生了重大的变化。2007年5月，太湖北部梅梁湾发生大规模水华事件；2008年，太湖北部竺山湾和西部沿岸湖区发生“黑水团”事件；2009～2010年，监测数据表明太湖水华暴发期间产生大量危害动植物健康的藻毒素。因此，针对湖泊水生植物来源磷的研究十分重要。有机磷(Organic P，Po)是水生植物中磷的重要组成部分，例如滇池水生植物中的Po可以占到其体内总磷(Total P，TP)的50％以上。另外，已有研究表明Po在水生生态系统的磷循环中扮演重要角色，一些Po组分可通过酶水解转化为生物可利用性活性磷酸盐，进而成为富营养化湖泊蓝藻水华持续暴发的重要磷源。由于分析测试方法的限制，对湖泊水生植物中Po化学结构和形态等的研究还十分有限，多数研究一般仅限于有机磷总量的分析。然而，自Newman[1]等将液相31P核磁共振(31P-NMR)技术首次应用土壤提取液中磷的分析，该分析方法很大程度上提高了我们对环境样品中Po组成结构和特征的认识。目前，该分析方法已成为表征环境中Po组成特征的强有力工具，但是主要集中于土壤、沉积物及腐殖质等物质的研究。如文献CN101339133A公开了一种钙质沉积物有机磷的提取及组成分析方法，其特征是先采用偏酸性的乙二胺四乙酸溶液对沉积物进
行冲洗并离心，再结合传统提取方法NaOH加乙二胺四乙酸(EDTA)混合溶液对沉积物进行振荡提取并离心，然后取部分NaOH+EDTA提取液用光谱仪测定总磷，将剩余提取液进行浓缩，最后用31P核磁共振技术(31P-NMR)分析提取液中有机磷的组成。该专利技术公开的是沉积物的提取方法，其缺点是提取率不高。CN104614331A公开了一种同时提取及分析水体沉积物中有机磷和无机磷形态的方法解决现有磷形态提取法不能同时测定出水体沉积物中有机磷和无机磷含量的问题。该专利技术的技术方案为：将水体沉积物样品与第一提取液混合、离心并过滤后，得到第一残渣和第一磷提取液；将第一残渣与第二提取液混合、离心并过滤后，得到第二残渣和第二磷提取液；将第二残渣与第三提取液混合、振荡、离心并过滤后，得到第三残渣和第三磷提取液；将第三残渣与第四提取液混合、振荡、离心并过滤后，得到第四残渣和第四磷提取液；将第四残渣灰化后与第五提取液混合、振荡、离心并过滤，得到第五磷提取液。该专利技术能准确反映水体沉积物中各形态有机磷和无机磷含量。但关于湖泊水生植物中有机磷提取及组成分析方法还鲜有报道，因此，对湖泊中的水生植物中有机磷的提取及组分分析研究，这对探索湖泊水生植物Po在水华暴发过程中所做的贡献以及湖泊内源磷循环及机理具有重要科学意义。[1]Newman R,Tate K.Soil phosphorus characterization by 31P nuclear magnetic resonance[J].Communications in Soil Science&Plant Analysis,1980,11(9):835-842.
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种湖泊水生植物中有机磷提取及组成分析方法，优化其有机磷的提取方法和31P-NMR测定过程中的参数设置，并分析水生植物中磷的组成结构特征。本专利技术的技术方案如下。一种湖泊水生植物中有机磷提取方法，包括以下步骤：(1)样品采集：采集湖泊水生植物全株，装入密封袋冷藏保存，运回实验室进行冷冻干燥，冷干后充分研磨，过2mm筛，得到水生植物粉末样品，-20℃冷冻保存备用；(2)磷的基本组成测定：总磷TP、无机磷Pi和有机磷Po的测定，取水生植物粉末样品两份，一份于马弗炉中煅烧，样品降至室温后加入HCl振荡，离心分离后分析其中磷浓度，即TP含量；另一份样品置于离心管中，加入HCl振荡，离心后测定磷浓度，即Pi含量；水生植物中Po的含量由TP和Pi相减得到；(3)Po的提取：取水生植物粉末样品加入提取剂，室温下振荡、离心后，留取上清液，
冷冻干燥形成粉末样品，冷冻保存备用；(4)样品测试预处理：将步骤(3)得到的粉末样品用NaOH溶解，离心，加入D2O锁定信号；(5)31P-NMR分析：采用BRUKER标准腔5mm BBO探头，31P的共振频率为161.98Hz，测定温度为20℃，谱峰宽度为5Hz，获取时间AQ为0.2102s，NMR参数中延迟时间D1的设置为5s，分析测试时间为15h；(6)计算：通过步骤(5)中得到的波谱进行积分及对各磷组分进行定性分析，并根据步骤(2)得到的TP含量计算水生植物中各磷组分的含量。优选的，所述TP的测定具体为：准确称取0.5g水生植物粉末样品一份，3个平行样，于马弗炉中450℃煅烧3h，降至室温后转移至离心管中，加入20mL3.5mol/L HCl振荡16h，离心分离后，上清液用0.45μm滤膜过滤得提取液，利用5％过硫酸钾121℃消解30min，分析其中磷浓度，即TP含量。优选的，所述Pi的测定具体为：准确称取0.5g水生植物粉末样品一份，3个平行样，置于离心管中，加入20mL1mol/L HCl振荡提取16h，离心分离后，上清液用0.45μm滤膜过滤得提取液，测定磷浓度，即Pi含量。优选的，所述TP和Pi采用磷钼蓝法进行测定。优选的，所述(3)Po的提取具体为：取水生植物粉末样品0.5g加入提取剂，室温下振荡提取16h，4℃条件下，8000×g离心30min后留取上清液，冷冻干燥形成粉末样品，冷冻保存备用。优选的，所述步骤(4)中NaOH为0.6mL 10mol/LNaOH；所述离心为8000×g离心15min；所述D2O为0.2ml。优选的，所述提取剂为0.5mol/L NaOH+25mmol/L EDTA。优选的，所述步骤(3)中，水生植物粉末样品与提取剂的固液比为1：60。优选的，所述水生植物为狐尾藻、芦苇和轮叶黑藻。分析得到，水生植物中磷由正磷酸盐、单酯磷、二酯磷以及焦磷酸盐组成，Po占T本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种湖泊水生植物中有机磷提取方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)样品采集：采集湖泊水生植物全株，装入密封袋冷藏保存，运回实验室进行冷冻干燥，冷干后充分研磨，过2mm筛，得到水生植物粉末样品，‑20℃冷冻保存备用；(2)磷的基本组成测定：总磷TP、无机磷Pi和有机磷Po的测定，取水生植物粉末样品两份，一份于马弗炉中煅烧，样品降至室温后加入HCl振荡，离心分离后分析其中磷浓度，即TP含量；另一份样品置于离心管中，加入HCl振荡，离心后测定磷浓度，即Pi含量；水生植物中Po的含量由TP和Pi相减得到；(3)Po的提取：取水生植物粉末样品加入提取剂，室温下振荡、离心后，留取上清液，冷冻干燥形成粉末样品，冷冻保存备用；(4)样品测试预处理：将步骤(3)得到的粉末样品用NaOH溶解，离心，加入D2O锁定信号；(5)31P‑NMR分析：采用BRUKER标准腔5mm BBO探头，31P的共振频率为161.98Hz，测定温度为20℃，谱峰宽度为5Hz，获取时间AQ为0.2102s，NMR参数中延迟时间D1的设置为5s，分析测试时间为15h；(6)计算：通过步骤(5)中得到的波谱进行积分及对各磷组分进行定性分析，并根据步骤(2)得到的TP含量计算水生植物中各磷组分的含量。...
【技术特征摘要】
2015.12.15 CN 20151093779001.一种湖泊水生植物中有机磷提取方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)样品采集：采集湖泊水生植物全株，装入密封袋冷藏保存，运回实验室进行冷冻干燥，冷干后充分研磨，过2mm筛，得到水生植物粉末样品，-20℃冷冻保存备用；(2)磷的基本组成测定：总磷TP、无机磷Pi和有机磷Po的测定，取水生植物粉末样品两份，一份于马弗炉中煅烧，样品降至室温后加入HCl振荡，离心分离后分析其中磷浓度，即TP含量；另一份样品置于离心管中，加入HCl振荡，离心后测定磷浓度，即Pi含量；水生植物中Po的含量由TP和Pi相减得到；(3)Po的提取：取水生植物粉末样品加入提取剂，室温下振荡、离心后，留取上清液，冷冻干燥形成粉末样品，冷冻保存备用；(4)样品测试预处理：将步骤(3)得到的粉末样品用NaOH溶解，离心，加入D2O锁定信号；(5)31P-NMR分析：采用BRUKER标准腔5mm BBO探头，31P的共振频率为161.98Hz，测定温度为20℃，谱峰宽度为5Hz，获取时间AQ为0.2102s，NMR参数中延迟时间D1的设置为5s，分析测试时间为15h；(6)计算：通过步骤(5)中得到的波谱进行积分及对各磷组分进行定性分析，并根据步骤(2)得到的TP含量计算水生植物中各磷组分的含量。2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述TP的测定具体为：准确称取0.5g水生植物粉末样品一份，3个平行样，于马弗炉中450℃煅烧3h，降至室温后转移至离心管中，加入20mL3.5mol/L HCl振荡16h，离心分离后，上清液用0.45μm滤...
【专利技术属性】
技术研发人员：冯伟莹，吴丰昌，朱元荣，张琛，
申请(专利权)人：中国环境科学研究院，
类型：发明
国别省市：北京;11
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