本发明专利技术提供了昆虫杆状病毒表达载体、构建方法及其应用，所述昆虫杆状病毒表达载体包括含人抗体轻链Kappa保守区序列的昆虫杆状病毒表达载体I以及含人抗体重链IgG1保守区的昆虫杆状病毒表达载体II，所述表达载体I的序列如序列表SEQ ID 1所示，所述表达载体II的序列如序列表SEQ ID 2所示；还包括含α‑2，3‑唾液酸糖基转移酶ST3的昆虫杆状病毒表达载体III，所述表达载体III的序列如序列表SEQ ID 3所示。所述昆虫杆状病毒表达载体可高效表达含重链和轻链的人源化抗体。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程
，尤其涉及昆虫杆状病毒表达载体、构建方法及其应用。
技术介绍
抗体分子具备四聚体糖蛋白的复杂分子结构，其胞外表达遵循着\分泌蛋白\的一般规律：全抗体分子的轻、重链各自翻译后，经折叠、组装，糖基化修饰后才具生物活性。通过对已上市抗体的临床研究发现，宿主细胞对重组抗体的\翻译后修饰\，直接影响到抗体药物的临床疗效和免疫原性，所有IgG分子仅在每个Cγ2区域Asn-297存在一个保守的N-糖基化修饰位点。连接在该位点的糖链有助于维持IgG的四级结构和Fc稳定性,并为IgG与外源凝集素的结合提供糖基化修饰位点。正常人IgG的Fc寡糖主要是核心岩藻糖基化的复杂双天线型,多因末端糖的半乳糖基化和唾液酸化产生异质性。根据末端半乳糖数量,可将Asn-297连接的双天线32聚糖糖链分成三个不同亚型IgG-G0,-G1,-G2,分别占整个人血清IgG糖链的35％、35％和16％；其他的14％为唾液酸化的G1和G2型的糖链。此外,人类IgG中还存在少量有(或无)二等分乙酰葡糖胺的无岩藻糖Fc糖链。昆虫产生唾液酸化糖蛋白的N-糖链是昆虫糖生物学和利用昆虫杆状病毒表达系统比较矛盾的一个问题。很多证据表明，在昆虫细胞株中没有唾液酸和唾液酸转运酶的活性，杆状病毒表达系统表达的重组糖蛋白的糖链末端没有唾液酸化。所有在标准昆虫杆状病毒表达系统中，其中以sf21、sf9和BTI-Tn-5B1-4(High Five)细胞作为宿主，重组N-糖蛋白的糖链是简单的、没有唾液酸化的低甘露糖型，而不是哺乳动物在相同糖基化位置产生的唾液酸化的复合型糖链。细胞系SfSWT-1(含有GnT1，GnT2,GalT,ST3，ST6等5个哺乳动物细胞糖基转移酶基因)具有能够很好地使重组糖蛋白的糖链唾液酸化的能力。我们知道Sf9细胞系不具有CMP-sialic acid，而这种物质是sialyltransferase酶活性的
底物。随后发现SfSWT-1中表达的重组糖蛋白的糖链唾液酸化，需要将该细胞放在含有外加唾液酸的培养基中培养，就像要添加FBS一样，表明这些昆虫细胞具有补偿型营养途径。不过这个问题很快得到了解决，那就是将编码唾液酸合酶和CMP-唾液酸合成酶的哺乳动物基因插入SfSWT-1细胞内，得到的SfSWT-3细胞株，就能够在细胞内合成CMP-唾液酸，形成的糖链为双天线、末端单唾液酸化的复合型N-糖链，但该细胞要在含有N-乙酰甘露糖胺唾液酸前体物的培养基中生长。这里要特别强调的是，到目前为止所有由转基因昆虫细胞产生的糖链都在末端的α-1,6支链上没有唾液酸。这是因为尽管在SfSWT-1和SfSWT-3细胞株中引入老鼠ST3GalIV基因，但检测不到唾液酸转运酶活性，说明虽然从mRNA水平上能够检测到该基因的表达，但它不能编码一个具有活性的基因产物，这可能解释了目前为什么由这些细胞株表达的重组糖蛋白的糖链的末端没有两个唾液酸的原因。因此目前的工作重点是向SfSWT-1和SfSWT-3细胞系中转入能表达具有活性的ST3酶基因。
技术实现思路
针对现有技术中的上述问题，本专利技术的主要目的在于提供昆虫杆状病毒表达载体、构建方法及其应用，所述昆虫杆状病毒表达载体可高效表达含重链和轻链的人源化抗体。为了达到上述目的，本专利技术采用如下技术方案：昆虫杆状病毒表达载体，包括含人抗体轻链Kappa保守区序列的昆虫杆状病毒表达载体I以及含人抗体重链IgG1保守区的昆虫杆状病毒表达载体II，所述表达载体I的序列如序列表SEQ ID 1所示，所述表达载体II的序列如序列表SEQ ID 2所示；还包括含α-2，3-唾液酸糖基转移酶ST3的昆虫杆状病毒表达载体III，所述表达载体III的序列如序列表SEQ ID 3所示。作为进一步的优选，所述表达载体I、II、III为pFAST Bac1载体。作为进一步的优选，所述表达载体III的启动子为杆状病毒极早期弱启动子ie1。昆虫杆状病毒表达载体的构建方法，包括如下步骤：所述载体I的构建方法为：设计引物从pFUSE2ss-CLIg-hk载体上克隆人抗体轻链Kappa保守区片段，并连接到pFAST Bac1载体上；所述载体II的构建方法为：设计引物从pFUSEss-CHIg-hG1载体上克隆人抗体重链IgG1保守区片段，并连接到pFAST Bac1载体上；所述载体III的构建方法为：将pFAST Bac1载体的PH启动子置换成病毒极早期弱启动子ie1，以及克隆人α-2，3-唾液酸糖基转移酶ST3基因到含启动子ie1的所述pFAST Bac1载体上。作为进一步的优选，所述载体I的构建方法中，所述人抗体轻链Kappa保守区片段和pFAST Bac1载体各自经双酶切后，以3:1的摩尔比例混合后通过连接酶连接。作为进一步的优选，所述载体I的构建方法中，克隆的方法包括：以pFUSE2ss-CLIg-hk载体为模板，设计引物扩增pFUSE2ss-CLIg-hk载体的IgKappa轻链保守区。作为进一步的优选，所述载体I的构建方法中，所述引物为上游引物L1和下游引物L2，所述上游引物L1的序列如SEQ ID 4所示，所述下游引物L2的序列如SEQ ID 5所示。作为进一步的优选，所述载体II的构建方法中，所述人抗体重链IgG1保守区片段和pFAST Bac1载体各自经双酶切后，以3:1的摩尔比例混合后通过连接酶连接。作为进一步的优选，所述载体II的构建方法中，克隆的方法包括：以pFUSEss-CHIg-hG1载体为模板，设计引物扩增pFUSEss-CHIg-hG1载体的IgG1重链保守区。作为进一步的优选，所述载体II的构建方法中，所述引物为上游引物H1和下游引物H2，所述上游引物H1的序列如SEQ ID 6所示，所述下游引物H2的序列如SEQ ID 7所示。作为进一步的优选，所述载体I和载体II的构建方法中采用的扩增反应体系为：94℃预变性5min，94℃45s，58℃1min，72℃45s，共进行30个循环，72℃延伸10min。作为进一步的优选，所述载体III的构建方法中，所述置换包括如下：以pFAST Bac1载体质粒为模板，扩增pFAST Bac1载体不含pPH启动子的部分；合成杆状病毒极早期弱启动子ie1，将所述启动子ie1与扩增后的所述pFAST Bac1载体连接，得到含杆状病毒极早期弱启动子ie1的病毒表达载体。作为进一步的优选，所述载体III的构建方法中，所述扩增反应体系包括如下：采用pfu酶，扩增条件为:94℃2min，94℃15s，60℃30s，72℃90s，扩增35个循环，72℃7min，扩增片断长度为4647bp。作为进一步的优选，所述人α-2，3-唾液酸糖基转移酶ST3基因片段和含启动子ie1的pFAST Bac1载体各自经双酶切后，以2:1的摩尔比例混合后通过连接酶连接。作为进一步的优选，所述人α-2，3-唾液酸糖基转移酶ST3基因序列如SEQ ID 8所示。作为进一步的优选，所述载体I、载体II和载体III的构建方法中，所述双酶切为BamHI和HindIII双酶切。所述昆虫杆状病毒表达载体在制备全长抗体中的应用，所述应用包括如下方法：分别克隆分泌鼠单克隆抗体的杂交瘤细胞轻链可变区基本文档来自技高网...
【技术保护点】
昆虫杆状病毒表达载体，其特征在于：包括含人抗体轻链Kappa保守区序列的昆虫杆状病毒表达载体I以及含人抗体重链IgG1保守区的昆虫杆状病毒表达载体II，所述表达载体I的序列如序列表SEQ ID 1所示，所述表达载体II的序列如序列表SEQ ID 2所示；还包括含α‑2，3‑唾液酸糖基转移酶ST3的昆虫杆状病毒表达载体III，所述表达载体III的序列如序列表SEQ ID 3所示。
【技术特征摘要】
1.昆虫杆状病毒表达载体，其特征在于：包括含人抗体轻链Kappa保守区序列的昆虫杆状病毒表达载体I以及含人抗体重链IgG1保守区的昆虫杆状病毒表达载体II，所述表达载体I的序列如序列表SEQ ID 1所示，所述表达载体II的序列如序列表SEQ ID 2所示；还包括含α-2，3-唾液酸糖基转移酶ST3的昆虫杆状病毒表达载体III，所述表达载体III的序列如序列表SEQ ID 3所示。2.根据权利要求1所述的昆虫杆状病毒表达载体，其特征在于：所述表达载体I、II、III为pFAST Bac1载体。3.根据权利要求1或2所述的昆虫杆状病毒表达载体，其特征在于：所述表达载体III的启动子为杆状病毒极早期弱启动子ie1。4.如权利要求1-3任一项所述的昆虫杆状病毒表达载体的构建方法，其特征在于：所述方法包括：所述载体I的构建方法为：设计引物从pFUSE2ss-CLIg-hk载体上克隆人抗体轻链Kappa保守区片段，并连接到pFAST Bac1载体上；所述载体II的构建方法为：设计引物从pFUSEss-CHIg-hG1载体上克隆人抗体重链IgG1保守区片段，并连接到pFAST Bac1载体上；所述载体III的构建方法为：将pFAST Bac1载体的PH启动子置换成病毒极早期弱启动子ie1，以及克隆人α-2，3-唾液酸糖基转移酶ST3基因到含启动子ie1的所述pFAST Bac1载体上。5.根据权利要求4所述的昆虫杆状病毒表达载体的构建方法，其特征在于：所述载体I的构建方法中，所述人抗体轻链Kappa保守区片段和pFAST Bac1载体各自经双酶切后，以3:1的摩尔比例混合后通过连接酶连接；所述载体II的构建方法中，所述人抗体重链IgG1保守区片段和pFAST Bac1载体各自经双酶切后，以3:1的摩尔比例混合后通过连接酶连接。6.根据权利要求4所述的昆虫杆状病毒表达载体的构建方法，其特征在于：所述载体I的构建方法中，所述引物为上游引物L1和下游引物L2，所述上游引物L1的序列如SEQ ID 4所示，所述下游引物L2的序列如SEQ ID 5所示；所述载体II的构建方法中，所述引...
【专利技术属性】
技术研发人员：沈鹤霄，华权高，马峰，徐春雷，
申请(专利权)人：武汉金开瑞生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42
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