一种新颖的免疫细胞示踪方法技术

本申请提供了一种免疫细胞示踪方法，所述方法包括以下步骤：(1)提供免疫细胞；(2)用偶联荧光染料的抗体标记步骤(1)获得的免疫细胞，然后体外检测标记免疫细胞的荧光强度；(3)将标记好的免疫细胞注射到实验动物体内；(4)采用动物活体成像仪检测实验动物体内荧光强度；(5)计算数据，确定免疫细胞在体内的分布、迁徙和存活时间。本申请还提供了用于免疫细胞示踪方法的试剂盒。本申请的方法及试剂盒不引进新的基因、不添加底物，操作简便，快捷，可为生命科学领域特别是免疫学研究领域深入了解免疫活性细胞杀伤肿瘤细胞的机制以及肿瘤的过继性免疫细胞治疗的基础科研工作和临床应用提供技术支持，将进一步促进肿瘤临床治疗技术的发展。

【技术实现步骤摘要】

本申请属于免疫医学研究领域，涉及一种检测免疫细胞的方法和试剂盒，具体涉及一种示踪法检测免疫细胞的方法和试剂盒。
技术介绍
随着环境污染对人们生存空间和食品安全的影响，以及社会发展导致人们生活方式的改变，心血管疾病、癌症、糖尿病和慢性肺部疾病等非传染性疾病引起的死亡率不断上升，据统计在2012年导致全球死亡总数的68％，比2000年的60％有所上升。其中，特别是全球癌症病例将迅猛增长，因此抗肿瘤药物和疗法市场极其巨大。传统的癌症治疗方法化疗、放疗、手术治疗后因其强烈的副作用和免疫排斥反应，治疗效果并不尽人意。免疫细胞过继疗法出现后，正方兴未艾，因其来源于患者自体细胞，可在一定程度上避免发生强烈免疫排斥反应，因此成为未来癌症在治疗的新技术发展方向。肿瘤过继性细胞免疫治疗属于生物治疗方法中的一种，它是将体外激活的自体或异体免疫效应细胞，先进行扩增和功能的鉴定，最后再输送到患者体内，以杀伤患者体内肿瘤细胞。过继免疫细胞在体内发挥作用受许多因素的影响，其中一个重要因素就是免疫效应细胞能否到达靶器官，实现与肿瘤细胞的直接接触，从而有效杀伤肿瘤细胞，因此在过继免疫细胞疗法的临床前研究中，用快速、方便、低成本的监测方法了解免疫活性细胞的分布、迁徙和存活时间成为限制过继免疫细胞疗法的临床前研究以及癌症治疗新技术的关键和重要技术。当前观察免疫活性细胞的分布、迁徙和存活时间的方法包括组织病理学技术、核素成像技术、磁共振成像技术、光学成像技术。其中，组织病理学技术须在不同的时间点将组织从活体中取出或者处死实验动物进行标记从而了解细胞在体内的情况，具有不能实时动态观察同一移植细胞在体内的分布和迁移的缺陷；核素成像技术即应用相机、单光子发射计算机断层显像(SPECT)和正电子发射断层显像(PET)等技术，所需PET和SPECT都是观察体内细胞分布方面高灵敏度和高分辨率的仪器，仪器昂贵并且需采取专门措施防护辐射污染。磁共振成像技术即利用人体组织中某种原子核的核磁共振现象，将所得射频信号经过电子计算机处理，重建出人体某一层面的图像的诊断技术，仪器也较昂贵，且需要造影剂，造影剂存在一定毒性。最近，运用生物发光剂和内源性荧光报告基因或者是外源性探针检测分子和生化进程的光学成像技术因其无放射性污染并且不许昂贵仪器优势，成为观察免疫活性细胞的分布、迁徙和存活时间的新发展方向。但是采用检测内源性报告基因示踪免疫细胞的方法由于需要将外源性基因转导到细胞内，可能存在一些不可预知的影响。常规生物发光剂(如荧光素酶)需要额外的向体内注射发光底物，且单次注射后持续发光时间短，并且特异性差，检测信号中包含多种非靶标细胞，影响对目标细胞种类及含量的正确评估。因此，在过继免疫细胞治疗研究领域，仍然亟待一种新的，简便高效，特异性强，可区分不同免疫细胞种类及同种免疫细胞不同亚群的分布、迁徙和存活时间的免疫细胞示踪方法。
技术实现思路
本申请的目的是提供一种无创，简便高效，特异性强的免疫细胞示踪方法，用于免疫细胞示踪的试剂盒和偶联荧光染料的抗体在制备用于免疫细胞示踪的试剂盒中的用途。本申请根据抗原抗体特异性结合反应以及抗体结合的荧光物质的激发光和发射光靠近偏红外，可穿过组织和皮肤而被检测到的原理，采用偶联荧光染料的特异性荧光抗体标记免疫细胞，将荧光抗体标记的免疫细胞注射到实验小动物体内，用小动物活体成像仪检测注射部位荧光信号强弱情况，确定免疫细胞的分布情况和数量。本申请提供了一种免疫细胞示踪方法，所述方法包括以下步骤：(1)提供免疫细胞；(2)用偶联荧光染料的抗体标记步骤(1)获得的免疫细胞，然后体外检测标记免疫细胞的荧光强度；(3)将标记好的免疫细胞注射到实验动物体内；(4)采用动物活体成像仪检测实验动物体内荧光强度；(5)计算数据，确定免疫细胞在体内的分布、迁徙和存活时间。在一些实施方案中，所述免疫细胞选自T细胞、B细胞、NK细胞、DC细胞、免疫调节细胞、造血母细胞。在一些实施方案中，所述T细胞包括CD3+、CD4+；所述B细胞包括CD19+；所述NK细胞包括CD3-/CD(16+56)+；所述免疫调节细胞包括CD4+/CD29+；所述造血母细胞包括CD33+和CD34+。在一些实施方案中，所述免疫细胞为T细胞，所述T细胞为CD3+。在一些实施方案中，所述荧光抗体上偶联的荧光染料选自共轭结合探针、Alexa Fluor系列荧光染料、Cy系列荧光染料、细胞功能探针、荧光蛋白和其他探针。在一些实施方案中，所述共轭结合探针包括Allophycocyanin(APC)、Texas Red；所述Alexa Fluor系列荧光染料包括Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 610、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 647；所述Cy系列荧光染料包括Cy3.5；所述细胞功能探针包括SNARF、Fluo-3；所述荧光蛋白包括TagYFP、EYFP和Topaz。在一些实施方案中，所述荧光抗体为别藻蓝蛋白-抗CD3抗体(APC anti-human CD3)。在一些实施方案中，所述步骤(2)是将免疫细胞与荧光抗体混匀后冰浴条件下孵育，所述孵育反应体系中，所述荧光抗体的用量为0.2～7.8μL，所述免疫细胞的用量为1～15×106个细胞，所述荧光抗体和免疫细胞结合的孵育时间为5mins～60mins，结合荧光抗体的免疫细胞体外检测的曝光时间为0.1s～200s。在一些实施方案中，所述步骤(2)是将免疫细胞与荧光抗体混匀后冰浴条件下孵育，所述孵育反应体系中，所述荧光抗体的用量为1～6μL，所述免疫细胞的用量为3～7×106个细胞，所述荧光抗体和免疫细胞结合的孵育时间为18mins～40mins，所述结合荧光抗体的免疫细胞体外检测的曝光时间为0.1s～80s。在一些实施方案中，所述步骤(3)中，将荧光抗体标记的免疫细胞注射入小动物体内遵守如下操作要求：A、所述小动物包括裸鼠，兔子，狗、猫，绵羊；B、荧光抗体标记的免疫细胞注射入小动物体内的部位选自腹部皮内注射，背部皮内注射，体内经尾静脉注射中的一种；C、接受所述荧光抗体标记的免疫细胞注射的小动物年龄为整个存活周期，优选存活中期；D、所述注射深度为皮下0～1cm组织。在本申请的免疫细胞示踪方法的一个具体实施例中，免疫细胞为CD3+T细胞。本申请的新颖的免疫细胞示踪方法的一些具体实施例中，荧光抗体是APC anti-human CD3。本申请的新颖的免疫细胞示踪方法的一个具体实施例中，APC anti-human CD3的用量为0.2μL。本申请的新颖的免疫细胞示踪方法的一个具体实施例中，APC anti-human CD3的用量为1μL。本申请的新颖的免疫细胞示踪方法的一个具体实施例中，APC anti-human CD3的用量为3μL。本申请的新颖的免疫细胞示踪方法的一个具体实施例中，APC anti-human CD3的用量为4.6μL。本申请的新颖的免疫细胞示踪方法的一个具体实施例中，APC anti-human CD3的用量为5.4μL。本申请的新颖的免疫细胞示踪方法的一个具体实施例中，APC anti-human CD3的用量为6.6μL。本申请本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种免疫细胞示踪方法，所述方法包括以下步骤：(1)提供免疫细胞；(2)用偶联荧光染料的抗体标记步骤(1)获得的免疫细胞，然后体外检测标记免疫细胞的荧光强度；(3)将标记好的免疫细胞注射到实验动物体内；(4)采用动物活体成像仪检测实验动物体内荧光强度；(5)计算数据，确定免疫细胞在体内的分布、迁徙和存活时间。

【技术特征摘要】
1.一种免疫细胞示踪方法，所述方法包括以下步骤：(1)提供免疫细胞；(2)用偶联荧光染料的抗体标记步骤(1)获得的免疫细胞，然后体外检测标记免疫细胞的荧光强度；(3)将标记好的免疫细胞注射到实验动物体内；(4)采用动物活体成像仪检测实验动物体内荧光强度；(5)计算数据，确定免疫细胞在体内的分布、迁徙和存活时间。2.根据权利要求1所述的免疫细胞示踪方法，其中，所述免疫细胞选自T细胞、B细胞、NK细胞、DC细胞、免疫调节细胞、造血母细胞。3.根据权利要求2所述的免疫细胞示踪方法，其中，所述T细胞包括CD3+、CD4+；所述B细胞包括CD19+；所述NK细胞包括CD3-/CD(16+56)+；所述免疫调节细胞包括CD4+/CD29+；所述造血母细胞包括CD33+和CD34+。4.根据权利要求1所述的免疫细胞示踪方法，其中，所述免疫细胞为T细胞，所述T细胞为CD3+。5.根据权利要求1所述的免疫细胞示踪方法，其中，所述荧光抗体上偶联的荧光染料选自共轭结合探针、Alexa Fluor系列荧光染料、Cy系列荧光染料、细胞功能探针、荧光蛋白和其他探针。6.根据权利要求5所述的免疫细胞示踪方法，其中，所述共轭结合探针包括Allophycocyanin(APC)、Texas Red；所述Alexa Fluor系列荧光染料包括Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 610、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 647；所述Cy系列荧光染料包括Cy3.5；所述细胞功能探针包括SNARF、Fluo-3；所述荧光蛋白包括TagYFP、EYFP和Topaz。7.根据权利要求1所述的免疫细胞示踪方法，其中，所述荧光抗体为别藻蓝蛋白-抗CD3抗体(APC anti-human CD3)。8.根据权利要求1所述的免疫细胞示踪方法，其中，所述步骤(2)是将免疫细胞与荧光抗体混匀后冰浴条件下孵育，所述孵育反应体系中，所述荧光抗体的用量为0.2～7.8μL，所述免疫细胞的用量为1～15×106个细胞，所述荧光抗体和免疫细胞结合的孵育时间为5mins～60mins，结合荧光抗体的免疫细胞体外检测的曝光时间为0.1s～200s。9.根据权利要求1所述的免疫细胞示踪方法，其中，所述步骤(2)是将免疫细胞与荧光抗体混匀后冰浴条件下孵育，所述孵育反应体系中，所述荧光抗体的用量为1～6μL，所述免疫细胞的用量为3～7×106个细胞，所述荧光抗体和免疫细胞结合的孵育时间为18mins～40mins，所述结合荧光抗体的免疫细胞体外检测的曝光时间为0.1s～80s。10.根据权利要求1所述的免疫细胞示踪方法，其中，所述步骤(3)中，将荧光抗体标记的免疫细胞注射入小动物体内遵守如下操作要求：A、所述小动物包括裸鼠，兔子，狗、猫，绵羊；B、荧光抗体标记的免疫细胞注射入小动物体内的部位选自腹部皮内注射，背部皮内注射，体内经尾静脉注射中的一种；C、接受所述荧光抗体标记的免疫细胞注射的小动物年龄为整个存活周期，优选存活中期；D、所述注射深度为皮下0～1cm组织。1...

【专利技术属性】
技术研发人员：宮健，刘书磊，徐义，韩化敏，
申请(专利权)人：拜西欧斯北京生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11