一种抗PM-Scl抗体IgG的磁微粒化学发光定量测定试剂盒及制备和检测方法技术

本发明专利技术公开一种抗PM‑Scl抗体IgG的磁微粒化学发光定量测定试剂盒，该试剂盒包括：抗PM‑Scl抗体IgG校准品；抗PM‑Scl抗体IgG质控品；含生物素标记的PM‑SCL抗原和牛血清白蛋白的Tris缓冲液；含碱性磷酸酶标记的羊抗人多克隆抗体和牛血清白蛋白的Tris缓冲液；含有链霉亲和素标记的磁性微粒和牛血清白蛋白的Tris缓冲液；清洗液。该试剂盒的检测方法在传统的膜条免疫法和酶联免疫吸附法的基础上，将灵敏度和线性范围再提高3‑5个数量级、实现真正意义的定量检测，反应迅速，结果可靠，并能够配合全自动化学发光免疫分析仪实现全自动使用，对于临床诊断具有无可替代的重要价值。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物检测
更具体地，涉及一种抗PM-Scl抗体IgG的磁微粒化学发光定量测定试剂盒及制备和检测方法。
技术介绍
抗PM-Scl抗体主要用于重叠综合征，50-70％的重叠综合征患者中可检出这些抗体，在这些患者中可合并出现多肌炎(PM)、皮肌炎(DM)和进行性系统性硬化症(Scl)。抗PM-Scl抗体在进行性系统性硬化症(弥散型)中的阳性率为3％，在多肌炎和皮肌炎中的阳性率为8％。目前临床上抗PM-Scl抗体IgG的检测有膜条免疫法和酶联免疫吸附法。膜条免疫法应用的是膜条显色技术，其特点为固定几个项目在同一膜条测定，一般通过手工或者半自动膜条仪进行实验操作，最终通过肉眼进行定性判定，该技术灵敏度低，反应时间长，检测项目只能固定搭配组合，灵活性差。酶联免疫吸附法的灵敏度在膜条免疫法基础上有所提升，但仍然较低，并且线性范围窄，重复性差，反应时间也较长，仍然不能很好满足临床的应用。磁微粒化学发光免疫分析法，较以前的膜条免疫法和酶联免疫吸附法，在检测灵敏度、检测范围、检测时间及自动化操作上有了大大提高，且没有污染，临床应用广。目前，使用磁微粒化学发光分析法在抗PM-Scl抗体IgG免疫分析产品的应用仍未见。
技术实现思路
本专利技术的一个目的在于提供一种抗PM-Scl抗体IgG的磁微粒化学发光定量测定试剂盒，本专利技术提供的试剂盒将化学发光分析技术与磁性微粒分离技术相结合，采用生物素和碱性磷酸酶(ALP)分别标记抗原和抗体，以直径1-3μm的包被链霉亲和素的超顺磁性微粒作为分离试剂。ALP催化底物发光后，通过仪器测量发光强度计算出待测物浓度。该检测方法在传统的膜条免疫法和酶联免疫吸附法的基础上，将灵敏度和线性范围再提高3-5个数量级、实现真正意义的定量检测，反应迅速，结果可靠，并能够配合全自动化学发光免疫分析仪实现全自动使用，对于临床诊断具有无可替代的重要价值。本专利技术的另一个目的在于提供一种上述试剂盒的制备方法及检测方法。为达到上述目的，本专利技术采用下述技术方案：一种抗PM-Scl抗体IgG的磁微粒化学发光定量测定试剂盒，所述试剂盒包括：1)抗PM-Scl抗体IgG校准品，含抗PM-Scl抗体IgG和牛血清白蛋白的Tris缓冲液，所述抗PM-Scl抗体IgG校准品为6个水平的液体校准品，所述6个水平的液体校准品中抗PM-Scl抗体IgG的浓度分别为0，5，20，50，100，200RU/mL；2)抗PM-Scl抗体IgG质控品，含抗PM-Scl抗体IgG和牛血清白蛋白的Tris缓冲液，所述抗PM-Scl抗体IgG质控品包含2个水平的液体质控品，所述2个水平的液体质控品中抗PM-Scl抗体IgG的靶值浓度范围分别为(20±4)RU/mL和(100±20)RU/mL；3)试剂1号，含生物素标记的PM-SCL抗原和牛血清白蛋白的Tris缓冲液；4)试剂2号，含碱性磷酸酶标记的羊抗人多克隆抗体和牛血清白蛋白的Tris缓冲液；5)磁分离试剂，含有链霉亲和素标记的磁性微粒和牛血清白蛋白的Tris缓冲液；6)清洗液；所述试剂盒中试剂1号，试剂2号和磁分离试剂的含量比为1:3:1，所述含量比为体积比。进一步的，所述磁微粒的材质为Fe2O3；所述磁微粒表面包被有羧基基团，包被物中羧基基团含量大于20wt％，所述磁微粒的大小为1-3μm。一种制备所述抗PM-Scl抗体IgG的磁微粒化学发光定量测定试剂盒的方法，该方法包括如下步骤：(1)配制抗PM-Scl抗体IgG校准品：a.配制抗PM-Scl抗体IgG校准品稀释液：将纯化水、Tris、氯化钠和Proclin300加入容器中，充分搅拌至完全溶解，Tris浓度为1wt％，氯化钠浓度为1wt％，Proclin300浓度为0.2v％；用4M的HCL将溶液的pH值调为7.0-7.5；将牛血清白蛋白加入容器中，充分搅拌至完全溶解，牛血清白蛋白的浓度为4wt％；再用4M的HCL将溶液的pH值调为7.0-7.5；用孔径为0.2μm的滤器过滤得抗PM-Scl抗体IgG校准品稀释液，2-8℃保存待用；b.配制抗PM-Scl抗体IgG校准品：将抗PM-Scl抗体IgG用抗PM-Scl抗体IgG校准品稀释液稀释至各浓度点为0，5，20，50，100，200RU/mL；(2)配制抗PM-Scl抗体IgG质控品：将抗PM-Scl抗体IgG用上述抗PM-Scl抗体IgG校准品稀释液稀释至各浓度点为20，100RU/mL；(3)配制试剂1号：a.配制试剂1号稀释液：将纯化水、Tris、氯化钠和Proclin300加入容器中，充分搅拌至完全溶解，Tris的浓度为1wt％，氯化钠浓度为0.5wt％，Proclin300的浓度为0.2v％；将牛血清白蛋白加入容器中，充分搅拌至完全溶解，牛血清白蛋白的浓度为0.5wt％；用4M的HCL将溶液的pH值调为7.0-7.5；用孔径为0.2μm的滤器过滤得试剂1号稀释液，2-8℃保存待用；b.配制试剂1号：将PM-Scl抗原用纯化水溶解，2-8℃条件下用浓度为0.2M，pH为9.0的碳酸盐缓冲液透析2h，然后浓缩至浓度为2-4mg/mL的抗原溶液，用浓度为0.2M，pH为8.5-9的碳酸盐缓冲液配制浓度为0.5-1.0mg/ml的生物素溶液；按照PM-Scl抗原与生物素质量比为10:1的比例在PM-Scl抗原溶液中加入生物素溶液，混合均匀，室温静置12-18h，反应生成PM-Scl抗原-生物素连接物；将含有PM-Scl抗原-生物素连接物的反应液在2-8℃条件下用浓度为0.2M，pH为9.0的碳酸盐缓冲液透析2天，期间进行4次换液，从而除去未反应的生物素，得到含有PM-Scl抗原-生物素连接物的溶液；用试剂1号稀释液将含有PM-Scl抗原-生物素连接物的溶液稀释到0.1-0.3μg/mL，制得试剂1号；本步骤配制的试剂1号可降低实验成本，而且能有效分离游离生物素和连接物，得到的连接物较纯，减少了后续的非特异反应；(4)配制试剂2号：a.配制试剂2号稀释液：将纯化水、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、氯化钠、牛血清白蛋白、ZnCl2、Proclin300加入容器中，充分搅拌至完全溶解，4-羟乙基哌嗪乙磺酸的浓度为0.6wt％，氯化钠浓度为0.8wt％，牛血清白蛋白的浓度为0.5wt％，ZnCl2的浓度为0.1wt‰，Proclin300的浓度为0.2v‰，MgCl2的浓度为0.1‰；用4M的HCL将溶液的pH值调为7.5-8.0；用孔径为0.2μm的滤器过滤得试剂2号稀释液，2-8℃保存待用；b.配制试剂2号：将1mg羊抗人多克隆抗体加入到2-4μL浓度为10mg/mL的2-亚氨基硫烷盐酸盐溶液中，室温静置20min，再加入0.1moL/L的甘氨酸溶液10μL，室温静置5min，用G-25凝胶柱除盐，收集活化后的羊抗人多克隆抗体，2-8℃保存备用；将1.5mg的碱性磷酸酶加入到10-20μL的浓度为5mg/mL的4-(N-马来酰亚
胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯溶液中，室温静置30min，用G-25凝胶柱除盐，收集活化后的碱性磷酸酶，2-8℃保存备用；将活化的羊抗人多克隆抗体与活化的碱性磷酸酶混合，2-8℃条件下静置12-24h，用Su本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗PM‑Scl抗体IgG的磁微粒化学发光定量测定试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：1)抗PM‑Scl抗体IgG校准品，含抗PM‑Scl抗体IgG和牛血清白蛋白的Tris缓冲液，所述抗PM‑Scl抗体IgG校准品为6个水平的液体校准品，所述6个水平的液体校准品中抗PM‑Scl抗体IgG的浓度分别为0，5，20，50，100，200RU/mL；2)抗PM‑Scl抗体IgG质控品，含抗PM‑Scl抗体IgG和牛血清白蛋白的Tris缓冲液，所述抗PM‑Scl抗体IgG质控品包含2个水平的液体质控品，所述2个水平的液体质控品中抗PM‑Scl抗体IgG的靶值浓度范围分别为(20±4)RU/mL和(100±20)RU/mL；3)试剂1号，含生物素标记的PM‑Scl抗原和牛血清白蛋白的Tris缓冲液；4)试剂2号，含碱性磷酸酶标记的羊抗人多克隆抗体和牛血清白蛋白的Tris缓冲液；5)磁分离试剂，含有链霉亲和素标记的磁性微粒和牛血清白蛋白的Tris缓冲液；6)清洗液；所述试剂盒中试剂1号，试剂2号和磁分离试剂的含量比为1:3:1，所述含量比为体积比。

【技术特征摘要】
1.一种抗PM-Scl抗体IgG的磁微粒化学发光定量测定试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：1)抗PM-Scl抗体IgG校准品，含抗PM-Scl抗体IgG和牛血清白蛋白的Tris缓冲液，所述抗PM-Scl抗体IgG校准品为6个水平的液体校准品，所述6个水平的液体校准品中抗PM-Scl抗体IgG的浓度分别为0，5，20，50，100，200RU/mL；2)抗PM-Scl抗体IgG质控品，含抗PM-Scl抗体IgG和牛血清白蛋白的Tris缓冲液，所述抗PM-Scl抗体IgG质控品包含2个水平的液体质控品，所述2个水平的液体质控品中抗PM-Scl抗体IgG的靶值浓度范围分别为(20±4)RU/mL和(100±20)RU/mL；3)试剂1号，含生物素标记的PM-Scl抗原和牛血清白蛋白的Tris缓冲液；4)试剂2号，含碱性磷酸酶标记的羊抗人多克隆抗体和牛血清白蛋白的Tris缓冲液；5)磁分离试剂，含有链霉亲和素标记的磁性微粒和牛血清白蛋白的Tris缓冲液；6)清洗液；所述试剂盒中试剂1号，试剂2号和磁分离试剂的含量比为1:3:1，所述含量比为体积比。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述磁微粒的材质为Fe2O3；所述磁微粒表面包被有羧基基团，包被物中羧基基团含量大于20wt％，所述磁微粒的大小为1-3μm。3.一种制备如权利要求1-2任一项所述试剂盒的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：(1)配制抗PM-Scl抗体IgG校准品：a.配制抗PM-Scl抗体IgG校准品稀释液：将纯化水、Tris、氯化钠和Proclin300加入容器中，充分搅拌至完全溶解，Tris浓度为1wt％，氯化钠浓度为1wt％，Proclin300浓度为0.2v％；用4M的HCL将溶液的pH值调为7.0-7.5；将牛血清白蛋白加入容器中，充分搅拌至完全溶解，牛血清白蛋白的浓度为4wt％；再用4M的HCL将溶液的pH值调为7.0-7.5；用孔径为0.2μm的滤器过滤得抗PM-Scl抗体IgG校准品稀释液，2-8℃保存待用；b.配制抗PM-Scl抗体IgG校准品：将抗PM-Scl抗体IgG用抗PM-Scl抗体IgG校准品稀释液稀释至各浓度点
\t为0，5，20，50，100，200RU/mL；(2)配制抗PM-Scl抗体IgG质控品：将抗PM-Scl抗体IgG用上述抗PM-Scl抗体IgG校准品稀释液稀释至各浓度点为20，100RU/mL；(3)配制试剂1号：a.配制试剂1号稀释液：将纯化水、Tris、氯化钠和Proclin300加入容器中，充分搅拌至完全溶解，Tris的浓度为1wt％，氯化钠浓度为0.5wt％，Proclin300的浓度为0.2v％；将牛血清白蛋白加入容器中，充分搅拌至完全溶解，牛血清白蛋白的浓度为0.5wt％；用4M的HCL将溶液的pH值调为7.0-7.5；用孔径为0.2μm的滤器过滤得试剂1号稀释液，2-8℃保存待用；b.配制试剂1号：将PM-Scl抗原用纯化水溶解，2-8℃条件下用浓度为0.2M，pH为9.0的碳酸盐缓冲液透析2h，然后浓缩至浓度为2-4mg/mL的抗原溶液，用浓度为0.2M，pH为8.5-9的碳酸盐缓冲液配制浓度为0.5-1.0mg/ml的生物素溶液；按照PM-Scl抗原与生物素质量比为10:1的比例在PM-Scl抗原溶液中加入生物素溶液，混合均匀，室温静置12-18h，反应生成PM-Scl抗原-生物素连接物；将含有PM-Scl抗原-生物素连接物的反应液在2-8℃条件下用浓度为0.2M，pH为9.0的碳酸盐缓冲液透析2天，期间进行4次换液，从而除去未反应的生物素，得到含有PM-Scl抗原-生物素连接物的溶液；用试剂1号稀释液将含有PM-Scl抗原-生物素连接物的溶液稀释到0.1-0.3μg/mL，制得试剂1号；(4)配制试剂2号：a.配制试剂2号稀释液：将纯化水、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、氯化钠、牛血清白蛋白、ZnCl2和Proclin300加入容器中，充分搅拌至完全溶解，4-羟乙基哌嗪乙磺酸的浓度为0.6wt％，氯化钠浓度为0.8wt％，牛血清白蛋白的浓度为0.5wt％，ZnCl2的浓度为0.1wt‰，Proclin300的浓度为0.2v‰，MgCl2的浓度为0.1‰；用4M的HCL将溶液的pH值调为7.5-8.0；用孔径为0.2μm的滤器过滤得试剂2号稀释液，2-8℃保存待用；b.配...

【专利技术属性】
技术研发人员：不公告发明人，
申请(专利权)人：北京中航赛维生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11