本发明专利技术公开一种断奶仔猪炎症反应模型的建立方法及应用。它是用致病性大肠杆菌攻毒断奶仔猪来探讨该病原菌对仔猪血液中白细胞数量和血清中肿瘤坏死因子‑α（TNF‑α）浓度的影响。致病性大肠杆菌菌液浓度为1×1010~1×1011cfu结果表明：试验组显著提高仔猪血液中白细胞数量和血清中TNF‑α的浓度。由此可见，适当剂量的致病性大肠杆菌攻毒断奶仔猪能够诱导仔猪发生炎症反应。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于畜牧业动物医学技术研究领域，涉及一种以致病性大肠杆菌为病原菌的断奶仔猪炎症模型，更具体的说是用于研究药物的抗炎作用、评价抗炎药物的作用效果和研究抗炎药物的作用机制等方面的应用。
技术介绍
炎症是临床常见的一个病理过程，是机体血管系统的活体组织对损伤因子所产生的一种重要防御机制，也是机体最基本的抗损伤过程。适度的炎症反应可以促进伤口愈合、便于捕获微生物，对于病理性感染的控制非常重要，但是过度的炎症反应能够引起广泛的组织损伤，加剧感染性休克，甚至危及生命，因此抗炎药应运而生。万物是具有两面性的，抗炎药物也不例外。抗炎药只有使用得当它的功效才能发挥出来，否则就会适得其反。所以，如何选择合适的动物模型来研究药物的抗炎作用、初步评价抗炎药的作用效果和研究抗炎药物的作用机制是我们待研究的重要课题之一。目前，建立的体内炎症模型较多，主要集中在大鼠、小鼠和鸡等小型动物上，而在大型动物，比如断奶仔猪上建立体内炎症模型的案例还未见报道。断奶仔猪营养健康一直是养猪领域的研究重点，仔猪抗炎药物添加剂的筛选、作用机制及其合理使用是目前很多研究人员的主攻方向。通过致病性大肠杆菌灌服断奶仔猪建立仔猪炎症反应模型，将为抗炎药物作为饲料添加剂在仔猪上的开发及应用研究提供实验室技术支持，也会在一定程度上提高养猪业的经济效益。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是公开了一种断奶仔猪炎症反应模型的建立方法。本专利技术的另一个目的是公开了所建立的炎症模型对断奶仔猪血液中白细胞数目和促炎性细胞因子生成的影响。为实现上述目的，本专利技术公开了如下的
技术实现思路
一种建立断奶仔猪炎症反应模型的方法，其特征在于在病原菌使用中选择致病性大肠杆菌，对仔猪进行灌服，按如下的步骤进行：（1）致病性大肠杆菌攻毒用菌液的制备：将致病性大肠杆菌甘油菌液按照0.1%(w/w)的接种量转接入小量新鲜LB培养液中，培养18小时后，再按照0.1%(w/w)的接种量接种入大量新鲜LB培养液中，37℃，150 rpm，培养18小时后，4℃，3000rpm离心集菌，离心时间以大肠杆菌沉下来为准，弃去培养液，用无菌生理盐水洗涤1次，4℃，3000rpm离心集菌，弃去洗涤液，加入适量的（5~10 mL）生理盐水，4℃保存，待攻毒用；将待攻毒用的大肠杆菌，用生理盐水倍比稀释后，在LB琼脂板中进行CFU计数，确定攻毒用大肠杆菌的浓度；(2)试验动物及分组：采用单因子试验设计，选取健康去势杜×长×大三元杂交断奶仔猪6头，随机分为2组，每组3头猪，试验组每公斤体重灌服致病性大肠杆菌，菌液浓度为1×1010~1×1011cfu，对照组每公斤体重灌服等体积的生理盐水；（3）试验规程:1）试验在一个100 m2的动物房里进行，每头猪单笼饲养，试验期5天,饲养管理按照仔猪常规程序进行，仔猪自由采食饮水4天，攻毒前12 h停止供料，攻毒前2 h停止供水，攻毒前对每头猪进行前腔静脉采血，攻毒时对每头猪称重，根据体重计算攻毒剂量，试验组仔猪灌服致病性大肠杆菌，对照组仔猪灌服生理盐水；2）攻毒后2 h开始供水，仍继续停止供料直至实验结束；攻毒后3、6、12和24 h分别对每头猪进行前腔静脉采血;(4)测定指标：1）血液中白细胞数目测定：用含有乙二胺四乙酸二钾的抗凝血真空管采集前腔静脉血1 mL，颠倒4~5次充分混匀，进行血常规检测；2）血清中促炎性细胞因子测定：采用5 mL灭菌注射器前腔静脉采血1 mL，室温放置2 h后，常规方法分离血清，测定血清中的细胞因子。本专利技术所述建立断奶仔猪炎症反应模型的方法，其中所述的建立断奶仔猪炎症反应指的是：断奶仔猪血液中白细胞数目和促炎性细胞因子生成的影响。本专利技术所述的仔猪特征为：健康去势公猪，体重在6~8kg。所述的致病性大肠杆菌使用浓度优选是仔猪每公斤体重灌服1×1010cfu/mL。本专利技术所使用的致病性大肠杆菌特征为：购自中国兽医药品监察所，菌种保藏编号为CVCC3732。本专利技术进一步公开了建立断奶仔猪炎症反应模型的方法在研究制备致病性大肠杆菌诱导断奶仔猪炎症反应上的应用。主要指的是：提高断奶仔猪血液中白细胞数量和血清中TNF-α浓度方面的应用。致病性大肠杆菌攻毒仔猪实验结果表明：（1）仔猪灌服致病性大肠杆菌后，血液中白细胞数目显著增加，表明该致病性大肠杆菌能够促使白细胞渗出到血管外，呈现出细菌感染所致炎症反应最重要的特征。（2）仔猪灌服致病性大肠杆菌后，血清中TNF-α浓度显著增加，表明致病性大肠杆菌能够激活免疫细胞使其产生炎症介质，比如TNF-α等，介导机体炎症反应。试验结果表明建立的断奶仔猪炎症反应模型是成功的。为了更进一步说明本专利技术的模型效果，提供更加详细的试验：1. 致病性大肠杆菌攻毒用菌液的制备将致病性大肠杆菌甘油菌液按照0.1%的接种量转接入小量新鲜LB培养液中，培养18小时后，再按照0.1%的接种量接种入大量新鲜LB培养液中，37℃，150 rpm，培养18小时后，4℃，3000rpm离心集菌，离心时间以大肠杆菌沉下来为准，弃去培养液，用无菌生理盐水洗涤1次，4℃，3000rpm离心集菌，弃去洗涤液，加入适量的生理盐水，4℃保存，待攻毒用。将待攻毒用的大肠杆菌，用生理盐水倍比稀释后，在LB琼脂板中进行CFU计数，确定攻毒用大肠杆菌的浓度。2. 试验动物及分组采用单因子试验设计，选取体重7.12 ± 0.48 kg的健康去势杜×长×大三元杂交断奶仔猪6头，随机分为2组，每组3头猪。试验组每公斤体重灌服致病性大肠杆菌1×1010cfu（菌液浓度为1×1010cfu/mL），对照组每公斤体重灌服等体积的生理盐水。致病性大肠杆菌购自中国兽医药品监察所，菌种保藏编号为CVCC3732。3. 试验规程试验在一个100 m2的动物房里进行，每头猪单笼饲养，试验期5天。饲养管理按照仔猪常规程序进行。仔猪自由采食饮水4天。攻毒前12 h停止供料，攻毒前2 h停止供水。攻毒前对每头猪进行前腔静脉采血。攻毒时对每头猪称重，根据体重计算攻毒剂量，试验组仔猪灌服致病性大肠杆菌，对照组仔猪灌服生理盐水。攻毒后2 h开始供水，仍继续停止供料直至实验结束；攻毒后3、6、12和24 h分别对每头猪进行前腔静脉采血。4. 测定指标血液中白细胞数目测定：用含有乙二胺四乙酸二钾的抗凝血真空管采集前腔静脉血1 mL，颠倒4~5次充分混匀，进行血常规检测。仪器为日本Sysmex公司XE-2100全自动血液分析仪；进口专用配套试剂、质控品和校准品。严格按照操作规程进行检测。血清中促炎性细胞因子测定：采用5 mL灭菌注射器前腔静脉采血1 mL，室温放置2 h后，常规方法分离血清。采用酶联免疫吸附试验（ELISA）测定血清中的细胞因子，试剂盒购自上海鑫乐生物公司。严格按照试剂盒操作说明书进行检测。5. 统计分析采用Excel数据分析中的单因素方差分析比较组间差异显著性，P<0.05为差异显著。本专利技术的使用方法：用致病性大肠杆菌灌服6~8 kg仔猪，灌服剂量为每公斤体重1×1010~1×1011cfu。本专利技术模型的评估：致病性大肠杆菌灌服仔猪后3~12 h血液中白细胞数量在18~28×109cells/mL，血清中TNF-α的浓度在80~180 ng/L。本专利技术各项指标的检测：按本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种建立断奶仔猪炎症反应模型的方法，其特征在于在病原菌使用中选择致病性大肠杆菌，对仔猪进行灌服，按如下的步骤进行：（1）致病性大肠杆菌攻毒用菌液的制备：将致病性大肠杆菌甘油菌液按照0.1%(w/w)的接种量转接入小量新鲜LB培养液中，培养18小时后，再按照0.1%(w/w)的接种量接种入大量新鲜LB培养液中，37℃，150 rpm，培养18小时后，4℃，3000rpm离心集菌，离心时间以大肠杆菌沉下来为准，弃去培养液，用无菌生理盐水洗涤1次，4℃，3000rpm离心集菌，弃去洗涤液，加入5~10 mL生理盐水，4℃保存，待攻毒用；将待攻毒用的大肠杆菌，用生理盐水倍比稀释后，在LB琼脂板中进行CFU计数，确定攻毒用大肠杆菌的浓度；(2)试验动物及分组：采用单因子试验设计，选取健康去势杜×长×大三元杂交断奶仔猪6头，随机分为2组，每组3头猪，试验组每公斤体重灌服致病性大肠杆菌，菌液浓度为1× 1010~1× 1011cfu，对照组每公斤体重灌服等体积的生理盐水；（3）试验规程:1）试验在一个100 m2的动物房里进行，每头猪单笼饲养，试验期5天,饲养管理按照仔猪常规程序进行，仔猪自由采食饮水4天，攻毒前12 h停止供料，攻毒前2 h停止供水，攻毒前对每头猪进行前腔静脉采血，攻毒时对每头猪称重，根据体重计算攻毒剂量，试验组仔猪灌服致病性大肠杆菌，对照组仔猪灌服生理盐水；2）攻毒后2 h开始供水，仍继续停止供料直至实验结束；攻毒后3、6、12和24 h分别对每头猪进行前腔静脉采血；(4)测定指标：1）血液中白细胞数目测定：用含有乙二胺四乙酸二钾的抗凝血真空管采集前腔静脉血1 mL，颠倒4~5次充分混匀，进行血常规检测；2）血清中促炎性细胞因子测定：采用5 mL灭菌注射器前腔静脉采血1 mL，室温放置2 h后，常规方法分离血清，测定血清中的细胞因子。...
【技术特征摘要】
1.一种建立断奶仔猪炎症反应模型的方法，其特征在于在病原菌使用中选择致病性大肠杆菌，对仔猪进行灌服，按如下的步骤进行：（1）致病性大肠杆菌攻毒用菌液的制备：将致病性大肠杆菌甘油菌液按照0.1%(w/w)的接种量转接入小量新鲜LB培养液中，培养18小时后，再按照0.1%(w/w)的接种量接种入大量新鲜LB培养液中，37℃，150 rpm，培养18小时后，4℃，3000rpm离心集菌，离心时间以大肠杆菌沉下来为准，弃去培养液，用无菌生理盐水洗涤1次，4℃，3000rpm离心集菌，弃去洗涤液，加入5~10 mL生理盐水，4℃保存，待攻毒用；将待攻毒用的大肠杆菌，用生理盐水倍比稀释后，在LB琼脂板中进行CFU计数，确定攻毒用大肠杆菌的浓度；(2)试验动物及分组：采用单因子试验设计，选取健康去势杜×长×大三元杂交断奶仔猪6头，随机分为2组，每组3头猪，试验组每公斤体重灌服致病性大肠杆菌，菌液浓度为1× 1010~1× 1011cfu，对照组每公斤体重灌服等体积的生理盐水；（3）试验规程:1）试验在一个100 m2的动物房里进行，每头猪单笼饲养，试验期5天,饲养管理按照仔猪常规程序进行，仔猪自由采食饮水4天，攻毒前12 h停止供料，攻毒前2 h停止供水，攻毒前对每头猪进行前腔静脉采血，攻毒时对每头猪称重，根据体重计算攻毒剂量，试验组仔猪灌服致病性大肠杆菌，对照组仔猪灌服生理盐水；2）攻毒后2 h开始供...
【专利技术属性】
技术研发人员：李海花，朱琪，王世琼，张全红，陈龙宾，乔家运，王文杰，
申请(专利权)人：天津市畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：天津;12
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