一种从临床样本中快速提取细菌基因组DNA的试剂盒和方法技术

本发明专利技术公开了一种从临床样本中快速提取细菌基因组DNA的试剂盒和方法，其中，所述试剂盒采用两种不同粒径的玻璃珠来破坏细菌细胞壁，使其破壁效果好，能同时适用于革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，提高了试剂盒的通用性，同时利用磁珠对基因组的高效提取，使试剂盒具有很好的灵敏度，从而可以适用于被不同细菌污染且细菌含量较低的临床样本。而本发明专利技术公开的提取方法克服了现有技术操作繁琐费时的缺陷，其仅包括样品裂解、磁性分离、洗涤、洗脱四个步骤，无需离心沉淀，操作简便省时使用自动化。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，具体地，涉及一种从临床样本中快速提取细菌基因组DNA的试剂盒和一种从临床样本中快速提取细菌基因组DNA的方法。
技术介绍
细菌感染是临床常见的感染性疾病，一旦细菌感染进入血液很容易发生败血症，通过血脑屏障进入脑脊液引起严重的脑膜炎或脑脊髓膜炎，如果早期不能得到及时的诊断和治疗，就会严重威胁患者健康甚至危及患者生命。传统的培养法、生物化学检测和免疫学检测等方法，缺乏敏感性和特异性，诊断周期长，不能早期快速的诊断病原菌感染，因此，寻找快速的诊断方法至关重要。随着分子生物学技术的发展，PCR技术以快速、敏感和特异等优点迅速地应用到微生物检测领域，PCR方法应用于临床细菌的检测，首要难题是临床标本中细菌DNA的制备。高效快速的细菌DNA制备方法是使用PCR方法对临床标本进行细菌检测的前提，也是提高PCR方法检测细菌灵敏度的关键。实际情况中临床标本中细菌丰度低、标本量有限以及样本中PCR反应抑制剂的存在严重限制着PCR技术在临床感染性疾病病原学诊断中的广泛应用，获得一定浓度和纯度的基因组DNA是进行细菌分子生物学研究的基础。目前，细菌基因组DNA提取方法常见的有细菌DNA提取试剂盒法、碱裂解法、溶菌酶法、煮沸法等，但是这些方法在处理临床标本中都具有一定的局限性。其中，应用细菌DNA提取试剂盒提取细菌基因组DNA效果好
但成本较高，提取步骤多时间长，受细菌量的影响较大，临床应用受到限制；碱裂解法操作简单，提取DNA纯度高，但提取时间长(通常需要2h以上)，并且有一定的腐蚀性；煮沸法时间较短、容易操作，但难以提取革兰阳性菌基因组DNA；溶菌酶法适用于革兰阳性菌和革兰阴性菌，但操作繁琐，成本较高，提取时间长，且溶菌酶对不同细菌的消化能力存在较大差异性，比如金黄色葡萄球菌对溶菌酶消化耐受较强，还有一些细菌能完全抵抗溶菌酶消化。因此需要建立一种通用于革兰阳性菌和革兰阴性菌、高效快速、简便并应用于临床标本中细菌DNA提取的方法。磁珠法是近几年才发展起来的DNA提取方法，其涉及的试剂不含氯仿、苯酚等毒性大的有机溶剂，提取步骤更简单，不需要离心，易于实现自动化。比如专利文献CN200910307632.1公开了“一种采用磁珠从样品中提取并纯化核酸的方法”，专利文献CN201110204053.1公开了“磁珠法提取细菌质粒DNA的试剂盒及其提取方法”，但是上述提取方法在用于提取临床样本中可能含有的细菌基因组DNA时，仍然存在提取效率较低的缺陷。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服目前的DNA提取方法在用于提取临床样本中可能含有的细菌基因组DNA时所存在的提取效率较低的缺陷，提供一种从临床样本(包括血清、血液、脑脊液、尿液等)中能够以较高提取效率分离纯化出高收率和高纯度的细菌基因组DNA的试剂盒。为了实现上述目的，本专利技术提供一种从临床样本中快速提取细菌基因组DNA的试剂盒，其中，所述试剂盒包括：蛋白酶K、裂解缓冲液、磁珠结合液、洗涤缓冲液和洗脱缓冲液；该试剂盒还包括粒径为710-1180μm的第一玻璃珠和粒径为425-600μm的第二玻璃珠，且所述第一玻璃珠与所述第二玻璃珠在使用时的重量比为1：(2-5)。本专利技术还提供了一种从临床样本中快速提取细菌基因组DNA的方法，其中，该方法包括以下步骤：(1)将临床样本与裂解缓冲液、蛋白酶K、粒径为710-1180μm的第一玻璃珠和粒径为425-600μm的第二玻璃珠混合并进行裂解，得到裂解产物；其中，所述第一玻璃珠与所述第二玻璃珠的重量比为1：(2-5)；(2)将步骤(1)得到的裂解产物与磁珠结合液混合并进行结合和磁分离且弃去液体，得到磁分离产物；(3)将步骤(2)得到的磁分离产物与洗涤缓冲液混合进行洗涤，得到洗涤产物；(4)将步骤(3)中的洗涤产物与洗脱缓冲液混合进行洗脱，得到洗脱产物。通过上述技术方案，本专利技术能够从临床样本(包括血清、血液、脑脊液、尿液等)中将可能含有的细菌基因组DNA以较高的收率和纯度提取出来。此外，本专利技术的具有以下几个优点：(1)通用性强，本专利技术采用混合玻璃珠破碎细菌细胞壁，其对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均起作用，而临床样品中通常同时含有多种革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，这样扩大了试剂盒的应用范围，并且提取到的核酸纯度高完整性好，可以直接用来进行PCR及RT-PCR等分子生物学实验研究及临床检测；(2)灵敏度高，本专利技术采用粒径为710-1180μm和425-600μm的两种规格玻璃珠混合，效果明显优于单一玻璃珠的破壁效果，避免了由于破壁不完全造成的漏提漏检，同时超顺磁性氧化硅纳米微珠对基因有非常好的富集效果，因而混合玻璃珠和磁珠的结合能够有效提高试剂盒的检测灵敏度，降低检测限，减少假阳性率，这样即使临床样本中的细菌量很少也能够得到正确的检测结果；(3)简便快速适于自动化，本专利技术只需要四步便完成细菌基因组的提取，克服了现有方法步骤繁多的缺点，省去了现有技术中的离心、沉淀等耗时步骤，约15min完成特定样品的提取，操作简单，并且可配合自动化核酸提取仪进行高通量提取；(4)安全环保，使用本专利技术方法提取核酸，不需要使用酚、氯仿等有毒的有机溶剂抽提，减少了对实验人员身体的伤害及对环境的影响。本专利技术的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本专利技术，并不用于限制本专利技术。本专利技术提供了一种从临床样本中快速提取细菌基因组DNA的试剂盒，其中，所述试剂盒包括：蛋白酶K、裂解缓冲液、超顺磁性氧化硅纳米微珠、洗涤缓冲液和洗脱缓冲液；其中，该试剂盒还包括粒径为710-1180μm的第一玻璃珠和粒径为425-600μm的第二玻璃珠，且所述第一玻璃珠与所述第二玻璃珠在使用时的重量比为1：(2-5)。其中，本专利技术采用的粒径为710-1180μm的第一玻璃珠和粒径为425-600μm的第二玻璃珠混合，效果明显优于单一粒径玻璃珠的破壁效果，且通用于革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的破壁；不仅避免了由于破壁不完全造成的漏提漏检，而且显著节省了实验操作时间。其中，根据本专利技术一种优选的实施方式，所述第一玻璃珠与所述第二玻璃珠在使用时的重量比为1：(2.5-3.5)。在该优选实施方式中，本专利技术能够进一步提高从临床样本中提取可能含有的细菌基因组DNA的收率和纯度。其中，所述裂解缓冲液可以含有2-6M的变性剂、20-100mM的缓冲盐、10-100mM的离子螯合剂和0.5-10重量％的表面活性剂，且pH值可以为6.2-7.2。所述磁珠结合液可以含有直径可以为200-400nm的超顺磁性氧化硅纳米微珠和乙醇，每1mL的磁珠结合液可以含有2-6mg的超顺磁性氧化硅纳米微珠。每1mL的磁珠结合液还可以含有50-99体积％的乙醇和余量的水。所述洗涤缓冲液可以10-20mM的缓冲盐和50-80体积％的乙醇，且pH值可以为7.0-7.2；可选地，所述洗涤缓冲液还可以含有2-4M的变性剂、1-6mM的离子螯合剂。所述洗脱缓冲液可以含有0-20mM的缓冲盐和0-2mM的离
子螯合剂，且pH值可以为8.0-8.5，所述洗脱缓冲液也可以为无菌水。本专利技术涉及的临床样品中细菌本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种从临床样本中快速提取细菌基因组DNA的试剂盒，其中，所述试剂盒包括：蛋白酶K、裂解缓冲液、磁珠结合液、洗涤缓冲液和洗脱缓冲液；其特征在于，该试剂盒还包括粒径为710‑1180μm的第一玻璃珠和粒径为425‑600μm的第二玻璃珠，且所述第一玻璃珠与所述第二玻璃珠在使用时的重量比为1：(2‑5)。

【技术特征摘要】
1.一种从临床样本中快速提取细菌基因组DNA的试剂盒，其中，所述试剂盒包括：蛋白酶K、裂解缓冲液、磁珠结合液、洗涤缓冲液和洗脱缓冲液；其特征在于，该试剂盒还包括粒径为710-1180μm的第一玻璃珠和粒径为425-600μm的第二玻璃珠，且所述第一玻璃珠与所述第二玻璃珠在使用时的重量比为1：(2-5)。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，所述第一玻璃珠与所述第二玻璃珠在使用时的重量比为1：(2.5-3.5)。3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其中，所述裂解缓冲液含有2-6M的变性剂、20-100mM的缓冲盐、10-100mM的离子螯合剂和0.5-10重量％的表面活性剂，且pH值为6.2-7.2；所述磁珠结合液含有直径为200-400nm的超顺磁性氧化硅纳米微珠和乙醇，每1mL的磁珠结合液含有2-6mg的超顺磁性氧化硅纳米微珠；所述洗涤缓冲液含有10-20mM的缓冲盐和50-80体积％的乙醇，且pH值为7.0-7.2；可选地所述洗涤缓冲液还含有2-4M的变性剂和1-6mM的离子螯合剂；所述洗脱缓冲液含有0-20mM的缓冲盐和0-2mM的离子螯合剂，且pH值为8.0-8.5。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其中，所述裂解缓冲液中的变性剂包括盐酸胍、异硫氰酸胍、碘化钠和碘化钾中的至少一种；所述缓冲盐为Tris-HCl；所述离子螯合剂为EDTA；所述表面活性剂包括Triton X-100、NP-40、Tween 20和SDS中的至少一种；所述洗涤缓冲液中的变性剂包括盐酸胍、异硫氰酸胍、碘化钠和碘化钾中的一种；所述洗脱缓冲液中的缓冲盐为Tris-HCl；所述离子螯合剂为EDTA。5.一种从临床样本中快速提取细菌基因组DNA的方法，其中，该方法包括以下步骤：(1)将临床样本与裂解缓冲液、蛋白酶K、粒径为710-1180μm的第一玻璃珠和粒径为425-600μm的第二玻璃珠混合并进行裂解，得到裂解产物；其中，所述第一玻璃珠与所述第二玻璃珠的重量比为1：(2-5)；(2)将步骤(1)得到的裂解产物与磁珠结合液混合并进行结合和磁分离且弃去...

【专利技术属性】
技术研发人员：王雷，陶金程，王晓艳，张志强，
申请(专利权)人：北京卓诚惠生生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11