本发明专利技术公开了一个受低温响应的早期水稻叶绿体发育基因及其检测方法和应用，该基因具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，编码的蛋白质具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。以dCAPs特异性引物 (SEQ ID No.5) (SEQ ID No.6)对水稻中所提取的DNA进行PCR扩增后，经MboⅡ酶切进行鉴定，能快速检测到含有该基因水稻的植株，其检测准确性高，操作简单。携带该基因的水稻在低温条件下早期水稻植株黄化，高温条件下恢复正常绿色。通过本发明专利技术得到的低温响应水稻温敏感叶色突变体在研究植物的叶绿体发育、叶绿素的生物合成以及其温度响应等分子机制具有重要意义，同时也可以作为标记性状提高杂交水稻的种子纯度，可应用于杂交水稻制种，可提高杂交水稻不育系自身以及它配制杂交水稻的纯度。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及农业和植物生物技术等领域，特别是在分子水平上进行水稻遗传育种以及生理、基因功能等基础研究。
技术介绍
叶片是植物进行光合作用的主要器官，类型丰富且易于鉴别，叶色变异是辨别植物突变最直观的性状之一。叶绿体是植物进行光合作用的场所，而叶绿体的发育受到一系列的核质互作基因的控制。研究表明控制叶绿体发育的基因被破坏可导致叶绿体发育受阻，进而使植物叶色发生异常，使光合作用效率下降，甚至植株死亡。目前，人们利用物理、化学、生物等诱变已得到水稻叶色突变体，将其应用于水稻的遗传育种、生理及其相关基因的克隆和功能研究。本研究利用经物理诱变得到的低温条件下水稻早期苗色突变体并通过图位克隆技术定位到一个受低温响应叶绿体发育的基因，至今尚未有与此水稻基因相关的文献报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一个受低温响应的早期水稻叶绿体发育基因、该基因编码的蛋白质及这个基因的检测方法和应用。携带该基因的水稻在低温条件下早期水稻植株黄化，高温恢复绿色。这种低温响应早期水稻叶绿体发育的基因，具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。优选的，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。该基因序列所编码的蛋白质，具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。优选的，该氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。一对用于检测受低温响应水稻叶绿体发育基因的特异性dCAPs PCR引物，其特征在于，其核苷酸序列：上游：5' GATTCGATGAAGCTTATCGGATACTTGCGAAG 3'下游：5' ATCCTTGGCATCACTGATACGG 3'即SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示序列。检测这种控制早期受低温响应水稻叶绿体发育基因的方法为，采用上述特异性dCAPs PCR引物对水稻植株所提取的DNA进行PCR扩增反应，由普通水稻（如嘉花1号）DNA扩增所得到的125bp片段，如SEQ ID No.3所示，能被MboⅡ酶切成33bp和92bp的两个特异性片段，而由携带该低温响应的叶绿体发育基因的水稻的DNA扩增得到的124bp长度，如SEQ ID No.4所示序列，不被MboⅡ酶切断，根据DNA能否被MboⅡ酶切可快速检测到是否含有此基因的水稻品种。水稻低温度响应叶色突变体材料是由粳稻“嘉花1号”经60Coγ射线辐照而来，经海南、上海两地多年自交加代和选择，已成为各种农艺性状稳定的品系。专利技术人在研究中将此突变品系与籼稻“广占63S”配制杂交组合，构建遗传群体，利用SSR和InDel分子标记将控制叶绿体发育的基因定位在水稻的第10号染色体。本专利技术控制低温响应叶绿体发育的基因本研究首先利用RNA干扰(RNAi)法验证水稻叶绿体发育相关基因的功能，通过构建pTCK303二元载体，转入农杆菌，再侵染野生型水稻嘉花1号的愈伤经分化获得突变体基因的RNAi苗，来验证基因功能，其RNAi植株叶色变黄（如图4），同样，利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术也验证了普通水稻（野生型）中的该等位基因的被破坏即可导致早期水稻叶绿体发育受阻，使植株黄化。本专利技术得到的控制低温响应早期水稻叶绿体发育的基因可应用于杂交水稻制种，该基因导入杂交水稻不育系可提高不育系自身以及由它配制杂交水稻的纯度。附图说明图1 为20℃条件下含有苗期低温响应叶绿体发育的基因水稻与野生型水稻对照图，其中左侧为含有苗期低温响应叶绿体发育的基因水稻，右侧为野生型水稻。图2 为32℃条件下含有苗期低温响应叶绿体发育的基因水稻与野生型水稻对照图，其中左侧为含有苗期低温响应叶绿体发育的基因水稻，右侧为野生型水稻。图3为本专利技术对PCR扩增产物进行MboⅡ酶切检测结果。T1代表野生型水稻酶切检测结果;T2代表含有低温响应叶绿体发育的基因酶切检测结果。图4为野生型、RNAi的T1代苗与苗期低温响应叶绿体发育的基因水稻对比图，其中左侧为野生型水稻、中间为RNAi的T1代苗期水稻，右侧为苗期低温响应叶绿体发育的基因水稻。图5为野生型与CRISPR/Cas9基因组编辑技术敲除的苗对比图，其中左侧为野生型水稻，右侧为CRISPR/Cas9基因组编辑技术敲除的苗期水稻。具体实施方式：实施例1：水稻DNA提取（CTAB法提取模板DNA）1．取1.0g水稻叶片，然后加液态N2研磨成粉末状，迅速转移到2.0 ml Eppendorf管中，再加入600 μl已预热的2×CTAB缓冲液(60℃)，混合均匀；2．将步骤1得到的溶液放置60℃水浴40分钟，每隔10min轻轻震荡4~6次，冷却至室温后，12000 r/min离心5min；3．小心吸取上清液600ul倒入新的2.0 ml Eppendorf管，再加入相同体积的异戊醇：氯仿(1:24)溶液，充分混匀，12000 r/min离心5min；4．小心吸取上清加入1.5 ml Eppendorf管，加入三分之二体积的异戊醇混匀，12000 r/min离心5min；5．弃上清，加入70%乙醇清洗DNA约1-2次，12000 r/min离心5min；6．弃上清，室温晾干或者40℃恒温箱烘干，加ddH2O溶解，4℃保存备用。实施例2：PCR扩增和基因检测总体积为50ul的PCR反应体系：再使用Eppendorf PCR扩增仪进行扩增。PCR反应程序：实施例3：检测获得低温响应早期水稻叶绿体发育的基因1、 25 μL PCR反应体系如下：100mM Tris-HCl pH9.0；100mM KCl; 20mM MgSO4；80mM (NH4)2SO4；2.5 mM dNTP; 10μM 引物，5U/μl Taq酶，1μl模板DNA/10μl。引物序列为：上游：5' GATTCGATGAAGCTTATCGGATACTTGCGAAG 3'下游：5' ATCCTTGGCATCACTGATACGG 3'2、酶切反应体系：22.5μl无菌水；20μl的PCR产物；5μl的10×MboⅡbuffer；2.5μl的MboⅡ酶。3、将酶切反应体系混匀后，放入37℃恒温水浴中，温浴3小时，每管加入3μl的10×Loading buffer终止酶切反应。将酶切产物上样与1%琼脂糖凝胶上并进行电泳，最后经溴化乙锭染色后在UVP凝胶成像仪上成像，结果如图3。实施例4：基因功能验证水稻低温响应叶色突变体材料tcd10来源于粳稻嘉花1号经 60Coγ射线诱变产生。经测序发现，突变型基因（TCD10）（SEQ No. 1）中的碱基A缺失，RNA表达水平降低，tcd10突变体在低温条件下早期植株黄化。另外，RNAi技术和CRISPR/Cas9基因组编辑技术实验结果，都表明普通水稻中的该等位基因（TCD10）的突变体后代都能使水稻叶色呈低温条件下黄化表型。1、利用SSR和InDel分子标记进行突变基因的定位，通过测序和利用实时荧光定量PCR技术(Real Time qPCR)对叶绿体发育、叶绿素合成以及光合作用相关基因进行RNA水平的表达量的分析，其RNA水平的表达量下降，这说明该基因影响低温条件下质体早期发育相关基因的表达，导致质体发育受阻，进而影响了叶绿体发育和光合色素的累积。2、本专利技术主要利用RNA干扰(RNAi)法验证一个水稻叶绿体发育相关基因的功能，本文档来自技高网...
【技术保护点】
一个受低温响应的早期水稻叶绿体发育基因，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
【技术特征摘要】
1.一个受低温响应的早期水稻叶绿体发育基因，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。2.根据权利要求1所述的一个受低温响应的早期水稻叶绿体发育基因，其特征在于：所述的基因序列所编码的蛋白质如SEQ ID No.2所示。3.一对用于检测权利要求1所述的受低温响应的早期水稻叶绿体发育基因的特异性dCAPs引物，其特征在于，其核苷酸序列为：上游：5' GATTCGATGAAGCTTATCGGATACTTGCGAAG 3'下游：5' ATCCTTGGCATCACTGATACGG 3'即SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示序列。4.检测权利要求1所述的受低温响应的早期水稻叶绿体发育基因的方法，其特征在于：...
【专利技术属性】
技术研发人员：吴兰兰，吴军，刘艳霞，林冬枝，董彦君，
申请(专利权)人：上海师范大学，
类型：发明
国别省市：上海;31
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